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《广州中医药大学》 2009年
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生脉成骨胶囊配合髋外展支架治疗儿童股骨头坏死的实验与临床研究

李显澎  
【摘要】: 1.研究目的 儿童股骨头缺血性坏死,也称Legg-Calve-Perthes病,是骨科的疑难杂病之一,在1910年前后分别由Legg、Calve、Perthes报道后,国内外已进行各个方面的研究,一直在不断加深对其认识中。儿童股骨头坏死的病因存在多种学说,在研究儿童股骨头坏死治疗方法过程中,针对其可能病因的治疗方法有了很多的报道,但是针对不能肯定的病因而设计的手术,有无必要,有无作用和副作用等问题有待深思,有待进行大量病例的长期随访和科学的疗效评价,现多数学者主张病因未明确前不宜选用创伤大过程复杂的手术。 祖国医学认为该病病机为肝肾不足,髓海空虚,不能滋养骨骼,如存在感受外邪等诱因,致使瘀血凝滞,经脉受阻,气血不通,这也是股骨头坏死的发病机理。股骨头坏死关键在于缺血。肾阴亏损、气滞血瘀是儿童股骨头坏死的常见病机,治疗上应以补益肝肾,活血化瘀,行气止痛为法。中药生脉成骨胶囊是治疗股骨头坏死的药物,在实验和临床上已经做了大量的研究,可以改善微循环、抑制细胞成脂、促进血管生成,治疗股骨头坏死具有较好的疗效。 根据病理改变的规律设计的治疗方法,已经受到国内外众多学者的重视,在自然修复的整个病理过程中,积极地采取避免股骨头变形的措施,比如髋外展支架,截骨包容法,可以根据生物性塑形使得髋关节达到匹配,具有较好的疗效和应用前景。 骨髓间质干细胞因其本身具有强大增殖能力和多向分化潜能,在修复创伤领域研究具有重要的意义。 本论文拟研究分离培养骨髓间质干细胞,然后采用补肾活血化瘀中药生脉成骨胶囊进行培养,观察对骨髓干细胞是否有增殖作用和促进成骨,初步分析这种作用可能是该药的作用机理之一。再回顾性研究对比多种方法处理儿童股骨头坏死的结果,即未系统治疗、髋外展支架治疗、中药配合支架治疗并进行初步分析,试探讨用中药和包容疗法治疗儿童股骨头坏死的应用价值。 2.研究方法 研究一:骨髓间质干细胞的分离培养和成骨分化的鉴定。 1.分离大鼠骨髓间质干细胞,在37℃、5g/LCO_2、饱和湿度条件下体外培养。培养后的第3天更换培养液以更新细胞代谢环境。以后每3 d换液1次,去除未贴壁的细胞,待细胞汇合约80%时,用2.5g/L胰蛋白酶(0.4g/L EDTA)消化,按1:2传代培养。 2.倒置显微镜下观察细胞生长的形态特性、取生长良好的2、3代细胞,2.5g/L胰蛋白酶消化,1×10~4/mL接种于24孔板,每天各取3孔消化计数,每孔计数3次,连续7d。以培养时间为横坐标,细胞数为纵坐标,描绘生长曲线。 3.用CD34,CD44,CD54抗体免疫法,钙钴法,矿化结节染色检测骨髓间质干细胞成骨作用。 研究二:生脉成骨胶囊对骨髓间充质干细胞增殖作用和成骨分化的实验研究。 1.制备生脉成骨胶囊含药血清:给予大鼠生脉成骨胶囊1 g/kg灌胃,于首次灌胃后2 h再次灌胃,末次灌胃1 h后腹主动脉采血,离心3000 r/min,20min。收集上清,过滤除菌。用L-DMEM配成含100 g/L含药血清的培养基。另一组以生理盐水灌胃、采血、培养基配制,配制成含空白血清的培养基。 2.选择合适密度的骨髓间质干细胞,给予用血清浓度10%的生脉成骨胶囊血清和空白组(即生理盐水灌胃)对骨髓间质干细胞在24孔板中进行培养,每天各取3孔消化计数,每孔计数3次,连续7d。以培养时间为横坐标,细胞数为纵坐标,描绘生长曲线。 3.于第7天时吸取出培养液,用PBS冲洗3次,每次1min,中性福尔马林室温固定10min蒸馏水冲洗3次,加入新鲜的孵育液37℃孵育6h,蒸馏水冲洗3次,20g/L硝酸钴水溶液浸泡5min,蒸馏水冲洗3次,10g/L硫化铵水溶液5min,水洗,中性树胶固定,标记,镜下观察。12d时的吸取出培养液,PBS清洗3次,950g/L乙醇固定30min,PBS清洗3次,1g/L茜素红染色,双蒸水冲洗3遍,中性树胶固定,标记,镜下观察。 研究三:儿童股骨头坏死的临床研究 1.采用临床回顾性研究为主的方法收集广州中医药大学第一附属医院髋中心2004年8月~2007年1月诊断为儿童股骨头坏死的患儿,进行病例随访,对治疗方法进行分类,有如下三类:未系统治疗、髋外展支架治疗、补肾活血化瘀中药生脉成骨胶囊配合髋外展支架治疗。用统计学的方法分析各组病例的年龄,Catterall分型,骨骺突出指数,VAS疼痛评分,Stulberg分型,Mose环标准,临床症状,以及各组治疗的有效率、优良率情况,然后将有效率行×列表的X~2检验观察相关治疗方法的结果评定。 3.研究结果 研究一:骨髓间质干细胞的分离培养和成骨分化的鉴定。 1.全骨髓培养法可以获得较好的骨髓间质干细胞,体外培养具有良好的增殖能力,细胞能在4~7d可完成原代培养。P2代细胞生长迅速,以1:3传代,3天即可铺满瓶底。形成均一性良好的单层细胞,在诱导液诱导下可见成骨分化。 2.实验发现MSCs的生长性状基本稳定,二代细胞的形态、生长曲线无显著性差异,细胞为均一的成纤维细胞样,潜伏适应期在第1~2天(约24h),对数生长期为第3~5天(约72h),以后进入平台期,在对数生长期,群体倍增时间34h,传代周期约6d,每传代1次细胞增加约2倍。 3.免疫法结果显示在MSCs膜上呈深红色,不透光为MSCs特性CD44(+)CD54(+),而不表达造血干细胞的特性CD34(-)。经诱导后的细胞,碱性磷酸酶染色明显,胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀,ALP活性部位呈棕黑色。茜素红染色可见红色的矿化结节颗粒,颗粒大小不均一,提示有矿化基质沉积。 研究二:生脉成骨胶囊对骨髓间充质干细胞增殖作用和成骨分化的实验研究。 1.采用生脉成骨胶囊血清培养骨髓间质干细胞,细胞计数法测定和对照组对比可见细胞增殖明显。 2.经中药血清培养后的细胞,碱性磷酸酶染色明显,胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀,茜素红染色可见红色的矿化结节颗粒,颗粒大小不均一。 研究三:儿童股骨头坏死的临床研究。 在临床研究中,共有75例78髋纳入,其中未系统治疗有18髋18例,髋外展支架治疗有18例19髋,中药配合支架治疗有39例41髋,经过3年随访,结果表明组内髋部疼痛VAS评分有差异(P<0.05)。股骨头的外形和骨骺的高度经过中药配合髋外展支架治疗恢复得较好。按Mose环标准,好8髋,可22髋,差11髋。头臼的匹配情况按照Stulberg分型,三组之间存在差异。整体的疗效评价用临床症状评价,三组之间以髋的活动度和步态经过比较存在差别,采用生脉成骨胶囊配合髋外展支架治疗儿童股骨头坏死较好,优良率为68.3%,有效率82.9%(P<0.05)。 4.结论 4.1用全骨髓培养法可以获得较好的骨髓间质干细胞,具有增殖能力和在诱导下具有定向分化能力。 4.2通过补肾活血化瘀中药生脉成骨胶囊含药血清的制备,在体外培养的情况下,和对照组相比,骨髓间质干细胞增殖明显,并且有成骨作用,这可能是该中药在临床上治疗股骨头坏死的机理之一。 4.3应用中药生脉成骨胶囊配合髋外展支架治疗儿童股骨头坏死病这一治疗方法有较好的疗效。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R726.8

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