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《广州中医药大学》 2010年
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川芎嗪对骨髓间质干细胞增殖、SDF-1mRNA表达及向心肌样细胞分化的实验研究

戴儒丽  
【摘要】: 目的 1、探讨大鼠骨髓间质干细胞(MMSCs)在体外进行分离、纯化及鉴定的方法。观察不同代的大鼠MMSCs的生长规律。 2、研究不同浓度川芎嗪对体外培养的MMSCs的增殖的影响。 3、检测不同浓度川芎嗪对MMSCs表达趋化因子SDF-1的影响。 4、研究川芎嗪能否影响体外MMSCs向心肌样细胞诱导分化。 方法 1、收集SD大鼠的股、胫骨骨髓内的细胞,采用全骨髓贴壁法进行体外培养。用相差显微镜观察细胞形态,用免疫荧光法鉴定细胞表面抗原CD34、CD44的表达及用MTT法了解第一至第五代MMSCs的生长情况。 2、第三代MMSCs分别在10个不同浓度的川芎嗪培养液中培养24h,然后通过MTT比色法检测细胞的活性情况来反映MMSCs的增殖情况。 3、取第三代MMSCs进行实验。选用0.08mmol/L、1.28mmol/L、5.12 mmol/L的川芎嗪及5μmol/L5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine,5-AZA)培养MMSCs 1d、3d、5d、7d,然后用RT-PCR法检测被干预后的干细胞的SDF-1 mRNA的表达。 4、实验分四组:MMSCs组、0.08 mmol/L川芎嗪组、1.28 mmol/L川芎嗪组及5μmol/L5-AZA组。药物干预时间分别为:5-AZA干预一天,川芎嗪干预十天。各组培养MMSCs的时间为1d、7d、21d(超过药物干预时间后,用和MMSCs组一样的培养液培养)。用RT-PCR法检测细胞的SDF-1受体CXCR-4 mRNA的表达及向心肌样细胞分化的指标Gata-4、Nkx2-5. MHC mRNA的表达。 结果 1、MMSCs原代培养1d后可见圆形细胞贴壁,3d后贴壁细胞数量明显增多,此时贴壁的细胞形态部分为长梭形,10d后细胞克隆融合,可传代。传代后,MMSCs在2h内贴壁生长,无潜伏期,克隆状增殖,细胞形态较一致,多为长梭形,呈“漩涡”样生长,5-6d可再传代。MMSCs表面抗原CD34表达阴性,CD44表达阳性。 2、在低浓度范围内(0-0.08 mmol/L),川芎嗪对细胞的增殖作用具有浓度依赖性,浓度越高越明显;但到达一定浓度后(1.28 mmol/L),随着川芎嗪浓度进一步增加,其对细胞的增殖反而有抑制作用。0.08 mmol/L的川芎嗪对MMSCs的增殖作用最强,该组与MMSCs组相比较,P0.01。 3、培养1d后,未诱导和5-AZA诱导的MMSCs均未明显表达SDF-1 mRNA,但随着培养时间的延长,SDF-1 mRNA的表达逐渐增强。0.08 mmol/L和1.28mmol/L的川芎嗪干预MMSCs 1d, SDF-1 mRNA的表达已出现。干预3d,川芎嗪组均可明显加快SDF-1 mRNA的表达。干预5d和7d,0.08mmol/L川芎嗪组促SDF-1 mRNA表达的作用高于其他诱导组。与7d MMSCs组相比,P0.01。 4、MMSCs组表达CXCR-4 mRNA的量是随培养时间的增多而减少,0.08 mmol/L川芎嗪组、1.28 mmol/L川芎嗪组对CXCR-4 mRNA的表达的作用有时间依赖性加强。在21d,与MMSCs组相比,0.08 mmol/L川芎嗪组、1.28 mmol/L川芎嗪组的CXCR-4 mRNA的表达有统计意义(P0.01)。 MMSCs组、0.08 mmol/L川芎嗪组、1.28 mmol/L川芎嗪组及5-AZA组均表达内参GAPDH,但是不表达Gata-4、Nkx2-5、心肌阳性对照组均表达Gata-4、Nkx2-5、 结论 1、采用全骨髓贴壁法体外分离和扩增MMSCs.所得MMSCs的活力及纯度均较高。此方法可以作为MMSCs的常规培养方法。 2、川芎嗪对体外培养的MMSCs的增殖作用与川芎嗪的浓度有关。 3、川芎嗪可促进MMSCs表达SDF-1 mRNA,有助于促进大鼠MMSCs向心梗局部的归巢。 4、川芎嗪能促进MMSCs表达CXCR-4 mRNA,但本实验在体外尚未发现川芎嗪诱导MMSCs向心肌样细胞转化的证据。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285.5

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【引证文献】
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