青天葵扩繁体系的建立和优化

【摘要】： 1目的 基于当前日臻成熟的青天葵组织培养技术,构建其扩繁体系,期望培育出的品种可代替野生资源作为药材的稳定来源之一,实现濒危植物青天葵药材资源的可持续利用。本课题从控制青天葵的污染并提出防治措施,同时对组培品、栽培品与野生品之间黄酮类成分组成比例分析比较等方面进行研究,为建立濒危植物青天葵扩繁体系及最终实现组织培养或人工栽培药材代替野生资源提供科学、详实的资料和依据,为进一步实现岭南道地药材——青天葵的大规模产业化奠定基础。 2方法 2.1青天葵组织培养污染控制与扩繁体系的建立 查阅现有文献,通过综述已有的青天葵组织培养技术,结合实验室的实际条件,建立可循环的青天葵扩繁体系。 总结在扩繁体系中遇到的污染问题,通过对污染的材料进行无菌水,生理盐水,升汞溶液,漂渍液,不同浓度次氯酸钠溶液的清洗效果比较研究,考察适宜的灭菌剂的浓度和时间。 2.2不同生长方式以及不同光质光育对青天葵中黄酮类成分影响的比较 以青天葵总黄酮含量为考察指标,通过对影响提取效果的溶剂浓度、溶剂量、提取时间、提取次数等四个主要因素进行正交设计试验,优化青天葵供试品提取工艺。 通过正离子模式电喷雾质谱仪对不同生长方式青天葵的黄酮类成分进行分析,检测三者之间黄酮类成分组成比例是否有差异。 进行绿色、黄色、红色、蓝色四种不同光质光对青天葵的生长影响预实验；同时进行青天葵栽培品与野生品,不同阶段野生品之间的苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活力测定预实验。 3结果 3.1污染基本得到控制,扩繁体系基本建立 被污染的青天葵组培物使用5%次氯酸钠溶液清洗10min后效果较好,不仅可基本抑制污染,植物材料仍能正常生长；升汞溶液虽可较彻底抑制污染,但对植物伤害较大,仅适用于对感染的球茎灭菌。 已建立起可重复的实验室青天葵扩繁体系,并成功收获第三代球茎,现正进行第四代球茎的扩繁。 3.2获得了优化的青天葵黄酮类成分提取工艺,考察不同生长方式以及不同光质的光对青天葵生长的影响 通过正交设计所得的较佳供试品提取工艺是用10倍量80%的乙醇加热回流提取2次,每次90min,所得的总黄酮含量较高。 经质谱初步定性比较,野生品、栽培品与组培品所含的黄酮类成分比较相近,但组成比例有较大差别；其中野生品与组培品的相关成分组成比例相似。 光育预实验中绿色光对青天葵生长影响较大,能加速该植物材料长出走茎；野生品的PAL酶活力略高于栽培品；六月份的野生品酶活力明显高于九月份的相同品种。 4结论 通过污染控制研究,能提高青天葵组织培养的成功率,尤其在进一步实现其规模化生产中极为有利。所得的黄酮类成分提取工艺可为青天葵扩繁体系的评价指标提供依据,对青天葵药材工业化大生产有一定的实际意义,也为进一步开发青天葵中总黄酮有效成分提供了较为科学合理的实验基础。人工栽培青天葵和组培得到的青天葵能否真正取代野生青天葵作为稳定的药材来源尚未有定论,仍需要进行相关的药理药效实验才能确定。 本研究成功建立了青天葵的扩繁体系。该体系的建立还可能形成成熟技术提供青天葵药材,为突破其资源贫乏濒危的瓶颈,进一步实现工业化生产打下基础。 但遗憾的是,青天葵生长速度缓慢,扩繁体系的一个循环约需历时半年。所进行的黄酮类成分评价研究未能对栽培青天葵和组培得到的青天葵能否真正取代野生青天葵作为稳定的药材来源下结论。同样由于青天葵增殖速率低,虽然已通过预实验证实不同光质的光对青天葵的生长确有影响,但尚未获得更多具有统计学意义的数据可进行整理统计证明。希望能在今后进一步的研究和探索中,解决以上问题和突破难关,最终突破青天葵资源贫乏濒危的瓶颈打下基础。