清毒扶正方药对ANLL-CR患者BMNC来源DC的诱导作用

【摘要】： 第一部分文献研究 急性白血病(AL)是血液科常见肿瘤之一,具有病情较重,发展较快,缓解后易于复发,长期生存率不高等特点,随着中、西医理论的完善、白血病的治疗方法不断开发和发展,使急性白血病的完全缓解率(CR)和长期生存率有了相当程度的提高,甚至完全治愈。但大部分患者即使完全缓解仍有复发,其根本原因就在于微量残留的白血病细胞的存在,对这种白血病的微小残留状态(MRD)防治是目前白血病研究的热点之一。 国内外比较一致的意见认为,微小残留白血病的存在除了与机体免疫功能有关外,与白血病细胞本身的免疫逃逸机制有更密切关系,所以杀灭微小残留白血病细胞必须依靠机体自身的免疫监视功能的正常发挥。而在微小残留白血病阶段,肿瘤负荷较小,并且经过长期化疗后残存下来的白血病细胞对药物的敏感性已经很低,此时应用免疫治疗辅助机体杀灭残存的肿瘤细胞是最好的时机。 中医基于对急性白血病正气虚弱,邪毒内侵的病因病机认识,目前对微小残留病的病理机制的认识基本一致,机体处于“邪去正衰”、“正气虚弱”而“余邪未尽”的病理生理状态。基于正气虚弱而邪毒未净是微量残留白血病的基本病理,多认为扶正祛邪治法是其基本的治疗。 第二部分实验研究 清毒扶正方药对ANLL-CR患者BMNC来源DC的诱导作用 1.研究目的 本实验用清毒饮、养正片含药血清配合细胞因子对急性髓细胞性白血病缓解期患者骨髓单个核细胞(BMNC)进行体外培养,观察树突细胞(DC)的诱导转化情况。以诱导转化的DC与纯化的正常人T细胞、患者自体T细胞共同培养,以激发T细胞,观察激发后的T细胞对人白血病细胞株K562细胞的杀伤作用。 清毒饮、养正片是本院研制的治疗急性白血病的有效中药制剂,本实验从中医药结合免疫治疗白血病的新途径出发,从提高缓解后患者的树突状细胞抗原提呈能力的新切入点,探讨中医药抗白血病的新作用机制,寻求中医治疗缓解后白血病并防止其复发的有效方法。 2.研究方法： 2.1标本来源 2.1.1骨髓单个核细胞来源于广州中医药大学第一临床医学院血液科住院急性髓系白血病患者缓解后(AML-CR)骨髓两例。患者均符合急性白血病诊断标准经标准方案化疗后完全缓解,符合急性白血病完全缓解标准。 2.1.2 T细胞来自正常成人外周血及白血病患者完全缓解后外周血各一例。 2.1.3白血病细胞株K562细胞。 2.2制备中药含药血清 取新西兰兔分组,分别以清毒饮、养正片、清毒饮合养正片按低、中、高剂量灌胃动物,制备三个组别的不同浓度的含药血清。 2.3分离骨髓去T细胞单个核细胞 应用羊红细胞玫瑰花结程序从骨髓中分离出去T细胞的骨髓单个核细胞(TD-MNC)。 2.4培养来源于AML-CR患者TD-MNC的DC 将TD-MNC细胞与不同中药含药血清与细胞因子联合培养,分为：清毒饮组、GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组、清毒饮+GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组、养正片组、养正片+GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组、清毒饮合养正片+GM-CSF+IL-4+IFN-α+TNF-α组。各含药血清组均分低、中、高剂量组。 2.5 DC鉴定：包括形态观察、免疫学检测、及其分泌的细胞因子IL-2、IL-6的测定。 2.6外周血T细胞的分离纯化(磁珠分选法) 正常人、AML-CR患者各取一份外周血50ml,经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PBMNC)后,采用磁珠阴性选择法制得纯化的外周血T细胞。流式细胞仪检测纯度。 2.7同种异体T细胞及自体T细胞的激发 分别收集纯化的同种异体T细胞、AML-CR患者自体T细胞,与AML-CR患者TD-MNC来源的DC以10：1比例加入24孔培养板培养5d,培养基中加入10OU/ml的IL-2。 2.8激发T细胞对K562细胞的杀伤作用(MTT法) 将各组T细胞与K562细胞分别以10：1、20：1、40:1效：靶比例培养,计算细胞杀伤率。 3.研究结果 本实验结果发现清毒饮+养正片组的低剂量组联合细胞因子可促进DC高表达CD1a、HLA-DR、CD80、CD86,并能促使DC高分泌细胞因子IL-2、IL-6,与对照组(细胞因子组)相比表达均明显升高,有统计学意义,说明清毒扶正中药可促进树突细胞的增殖和表达,提高树突细胞的抗原提呈能力。并且,各中药组内效靶比越高,杀伤率越高,这也说明T细胞浓度越大,对肿瘤细胞的杀伤率也越高。各中药组与对照组相比的结果说明,在某种浓度中药联合细胞因子可以比单纯用细胞因子更好地促进DC细胞的诱导转化,从而更强地激发T细胞,产生更大的杀伤力。 第三部分临床观察 附：清毒扶正方药对AL-CR患者骨髓细胞CD抗原表达及增殖的影响 1.研究目的 以清毒扶正为立法依据的清毒饮+养正片对照观察完全缓解后急性白血病患者治疗前后骨髓细胞CD34、CD34/CD2、CD34/CD19、CD13/CD33表达率,了解清毒扶正治法对微小残留白血病的治疗效果；通过对照观察患者治疗前后骨髓细胞增殖周期的变化,进一步探求该法治疗微小残留白血病的可能机制。 2.研究方法 本研究采用随机对照观察清毒扶正方药清毒饮+养正片对完全缓解的急性白血病患者骨髓细胞CD抗原表达及增殖周期的影响。 2.1病例来源来源于广州中医药大学第一附属医院血液科住院及门诊患者。 2.2治疗措施 2.2.1对照组：按常规化疗方案巩固维持治疗(ANLL用DA或MA或HA方案,ALL用VDP或VDLP方案)进行化疗,如出现感染、出血等情况,则按常规抗感染及止血治疗。 2.2.2观察组：西医治疗原则同对照组。巩固维持化疗的同时口服清毒饮、养正片方煎剂,日一剂,分二次服,持续4周。 2.2.3分别采集两组患者治疗前、治疗四周后的骨髓组织,进行实验观察。 2.3骨髓细胞CD抗原表达检测流式细胞仪测定患者治疗前后骨髓细胞CD34、CD34/CD2、CD34/CD19、CD13/CD33表达率。 2.4骨髓细胞增殖周期检测流式细胞仪检测患者治疗前后骨髓细胞增殖周期各时相表达率。 3.实验结果 本实验结合流式细胞仪对患者骨髓细胞增殖周期的测定,表明清毒扶正方药有抑制CD34表达的作用,说明清毒饮+养正片可能抑制了白血病细胞的增殖,从而使能代表髓系白血病细胞的CD13/CD14/CD33、代表淋巴系白血病细胞的CD3/CD19表达率下降。因而,扶正清毒方法可能对稳定病情、改善生活质量,甚至对提高急性髓性白血病患者生存期有宜。 第四部分研究结论 目前尚未见关于中药单体或复方在白血病肿瘤抗原提呈方面的作用研究。本论文用血清药理学方法率先研究方药复方制剂清毒饮、养正片协同细胞因子对完全缓解后急性白血病患者骨髓单个核细胞来源树突细胞诱导作用及其生物学特性的相关研究,并观察清毒扶正复方制剂在临床上对完全缓解后急性白血病患者骨髓细胞免疫表型及增殖周期的影响,探求清毒扶正方法对急性髓细胞白血病缓解后的可能治疗机制,为进一步开拓急性白血病缓解后的中医治疗方法做出努力。