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FTZ含药血清改善氧化应激引起的INS-1胰岛β细胞损伤的作用及机制探究

陈健媚  
【摘要】:研究背景:糖尿病是一组由于胰岛素抵抗及(或)胰岛素分泌缺陷引起的以高血糖为特征的代谢性疾病,已成为当前威胁人类健康的最重要的非传染性疾病之一。持续高血糖对胰岛β细胞的损伤在2型糖尿病发生、发展过程中所起的作用越来越受关注。高血糖引起的氧化应激是导致胰岛β细胞损伤的主要原因之一。本实验室前期研究表明,复方贞术调脂胶囊(Fu fang Zhen shu Tiao zhi Capsule,FTZ)具有降糖、降脂、抗凝、抗炎、保护血管内皮细胞等作用,能同时干预脂质的吸收、合成、转化、转运、分解、排泄等多个环节,对动脉粥样硬化、高脂血症、非酒精性脂肪肝等代谢性疾病具有很好的防治作用。但FTZ是否具有改善氧化应激引起的胰岛β细胞损伤、维持胰岛β细胞正常的功能和数量的作用尚不清楚。目的:1、探究FTZ含药血清改善高糖引起的氧化应激对INS-1胰岛β细胞损伤的作用及机制。2、探究FTZ含药血清改善氧化应激引起的INS-1胰岛β细胞凋亡的作用及机制。3、探究FTZ含药血清促进葡萄糖刺激的胰岛β细胞胰岛素释放的作用及机制。方法:1、将40只健康雄性SD大鼠平均分为2组,即给药组和空白组。大鼠禁食18h后灌胃FTZ混悬液,剂量为3 g提取物/kg体重。空白组灌予超纯水。连续灌胃3天,一天2次,末次灌胃1 h后腹主动脉取血。血液室温静止1h后离心处理(3000 r/min,15 min/次,2次),分离后合并同组大鼠血清,置水浴锅中,由室温开始升温至56℃,并维持30min。0.22μm滤膜过滤,制得ftz含药血清和大鼠空白血清。对ftz原料药、ftz含药血清、大鼠空白血清分别进行uplc/q-tof-ms分析。2、培养ins-1胰岛β细胞并进行分组,分别为对照组(control组),模型组(model组),阳性药物组(edaravone组),血清对照组(10%rat-serum组),低剂量含药血清组(0.4%ftz-serum组)、中剂量含药血清组(2%ftz-serum)和高剂量含药血清组(10%ftz-serum组)。control组细胞使用含有11mmol/l葡萄糖溶液和10%fbs的rpmi1640培养液进行培养;model组细胞使用含25mmol/l葡萄糖溶液和10%fbs的rpmi1640培养液进行培养;edaravone组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、200μmol/ledaravone和10%fbs的rpmi1640培养液进行培养;10%rat-serum组细胞使用含25mmol/l葡萄糖溶液和10%大鼠空白血清的rpmi1640培养液进行培养;0.4%ftz-serum组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、0.4%ftz含药血清和9.6%大鼠空白血清的rpmi1640培养液进行培养;2%ftz-serum组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、2%ftz含药血清和8%大鼠空白血清的rpmi1640培养液进行培养;10%ftz-serum组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液和10%ftz含药血清的rpmi1640培养液进行培养,给药后,均培养48h。3、采用dcfh-da荧光探针试剂盒检测细胞内的ros水平;mda检测试剂盒检测细胞内脂质过氧化水平;提取细胞总蛋白,采用westernblot方法检测细胞内mn-sod、cat蛋白表达水平。4、采用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪测定ins-1胰岛β细胞的凋亡率;采用caspase9活性检测试剂盒和caspase3活性检测试剂盒分别检测ins-1胰岛β细胞内凋亡蛋白酶caspase9和caspase3的活性;提取细胞总蛋白,采用westernblot方法检测细胞内的抗凋亡蛋白bcl-2/bcl-xl及促凋亡蛋白bax的蛋白表达水平。5、采用ratinsulinelisa试剂盒检测ins-1胰岛β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度;提取细胞总蛋白,采用westernblot方法检测细胞内pdx-1和glut2蛋白表达水平。结果:1、ftz原料药、ftz含药血清、大鼠空白血清的uplc/q-tof-ms图谱结果显示,FTZ含药血清含有一定浓度的药物成分,大鼠空白血清中不含有药物成分。2、与Control组细胞相比,Model组细胞内的ROS、MDA浓度显著上升;Mn-SOD、CAT蛋白表达水平显著下降。与Model组细胞相比,FTZ含药血清可显著降低细胞内ROS和MDA浓度,提高Mn-SOD、CAT的蛋白表达量。3、与Control组细胞相比,Model组细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表达量没有明显的变化,但是促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量显著提高,细胞内凋亡蛋白酶caspase 9和caspase 3的活性显著提高,细胞的凋亡率显著上升。与Model组细胞相比,FTZ含药血清可显著提高细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表达量,降低促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量,10%的FTZ含药血清还可显著降低细胞凋亡蛋白酶caspase 9和caspase 3的活性,不同浓度的FTZ含药血清均可显著降低细胞的凋亡率。4、与Control组细胞相比,Model组细胞的PDX-1和Glut 2蛋白表达量显著下降,葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度也显著降低。与Model组细胞相比,FTZ含药血清可显著提高细胞的PDX-1和Glut 2蛋白表达量,2%和10%FTZ含药血清可明显提高细胞中葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度。结论:1、FTZ含药血清可通过降低细胞内ROS和MDA浓度,提高Mn-SOD和CAT蛋白表达量,改善高糖引起的氧化应激损伤;2、FTZ含药血清可通过提高细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表达量,抑制促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量,降低细胞内caspase 9和caspase 3的活性,改善氧化应激引起的细胞凋亡;3、FTZ含药血清可通过提高细胞内PDX-1和Glut 2蛋白表达量,提高葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度,改善氧化应激引起的胰岛素释放功能受损。


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