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《广东药科大学》 2019年
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脂肪组织特异性nSREBP1c表达下小肠糖吸收功能研究及FTZ干预

余玉英  
【摘要】:目的:1、观察非肥胖性糖脂紊乱的aP2-nSREBP1c转基因小鼠模型小肠病理形态及肠道糖吸收功能特点。2、探讨aP2-nSREBP1c小鼠脂肪萎缩状态下肠系膜脂肪病理形态,其与肠道功能的相关性,以及SREBPs与肠糖吸收功能的可能性关系。3、从肠道糖吸收的角度出发,观察复方贞术调脂方(FTZ)对aP2-nSREBP1c脂肪萎缩模型小鼠糖代谢改善下,对肠道形态功能的影响,探讨FTZ改善糖脂代谢病的机制。方法:1、脂肪组织特异性nSREBP1c表达下小肠糖吸收功能研究。具体内容包括:1.1将雄性aP2-nSREBP1c小鼠确认基因型后随机分组,每周测量进食量和体质量,每3周检测禁食血和随机血血浆中GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C等血液指标;1.2小鼠14周龄时,进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)和腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT);1.3小鼠16周龄时,进行尿D-木糖实验;1.4取18周龄小鼠进行活体BrdU标记,1小时后颈椎脱臼处死,取材,量取肠管长度及重量;通过抗BrdU抗体特异性结合,免疫组化染色观察空肠增殖情况;1.5通过苏木素-伊红(HE)染色观察十二指肠、空肠、回肠和肠系膜脂肪组织的病理状态;1.6利用实时荧光定量方法(RT-PCR)检测肠系膜脂肪apelin、resistin、adiponectin等脂肪因子,十二指肠和空肠相关mRNA水平,包括糖吸收相关的Slc5a1、Slc2a1、Slc2a2、Slc2a5、Sgk1等,糖异生相关的G6pc、CREB、PEPCK等,胃肠激素相关的GIP、GCG、CHGA等,抗凋亡相关的IL15、BCL2L1、MCL1、BCL3等,增殖相关的Ki67、TGFβ、Gsk3β、β-catenin等,炎症因子相关的TNF-α、IL10、IL4、IL6等,和核转录因子相关的SREBP1、SREBP2、PPARα、PPARβ、PPARγ等;1.7利用Western-blot检测空肠SGLT1、SGLT2、GLUT2、GLUT5等糖转运相关蛋白水平;1.8通过免疫荧光观察空肠GLUT2和SGLT2蛋白的表达情况;1.9取25周龄小鼠,利用小肠在体单向糖灌流实验检测小肠糖吸收功能。2、复方贞术调脂方改善aP2-nSREBP1c小鼠糖代谢的药效及机制研究。2.1取8周龄aP2-nSREBP1c小鼠确定基因型后随机分为模型组(T)、二甲双胍组(Met)、复方贞术调脂方(FTZ)高(FH)、中(FM)、低(FL)剂量组,同窝野生型为对照组(W),每组6只。2.2二甲双胍组(250 mg·kg~(-1))、FTZ高、中、低剂量组(2.4 g·kg~(-1),1.2 g·kg~(-1),0.6 g·kg~(-1))分别灌胃给药,对照组和模型组小鼠灌胃给予等体积蒸馏水,连续给药16周,并记录体质量变化。2.3给药12周末,眼底静脉丛取血测量血中GLU、TC和TG;2.4给药16周末,解剖取材,量取肠管长度;2.5苏木素-伊红染色(HE)观察十二指肠、空肠、回肠和肠系膜脂肪形态变化;2.6实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测空肠Slc5a1、Slc2a1、Slc2a2、Slc2a5、Sgk1等糖转运相关mRNA水平和IL15、BCL2L1、MCL-1、BCL3等抗凋亡相关基因mRNA水平;2.7免疫荧光法检测空肠GLUT2和SGLT2蛋白表达水平。结果:1、aP2-nSREBP1c转基因小鼠有非肥胖性糖脂代谢紊乱表型;小肠肠管及肠绒毛长度增长的现象,空肠增殖相关Ki67、TGFβmRNA高表达,抗凋亡相关IL15、BCL2L1等mRNA水平上调;尿D-木糖排泄率升高,小肠总葡萄糖吸收量增加的现象,十二指肠和空肠SGLT1和GLUT2等糖转运相关mRNA与蛋白水平下调,空肠糖异生关键基因G6pc水平上调的现象。2、aP2-nSREBP1c脂肪代谢障碍模型小鼠肠系膜脂肪细胞数量锐减,结缔组织丰度增加,炎症侵润加重,肠系膜脂肪脂肪因子adiponectin低表达;空肠紧密连接蛋白ZO-1和claudin4高表达,小肠机械屏障能力加强;十二指肠SREBP1、SREBP2、PPARα、PPARβ等核转录mRNA下调,空肠PPARγ高表达,而肠系膜脂肪SREBP2、PPARα、PPARγmRNA水平均呈下降趋势。3、给药FTZ 16周后,aP2-nSREBP1c脂肪代谢障碍小鼠血糖和血浆总胆固醇降低,肠管及肠绒毛长度缩短,空肠GLUT2 mRNA和蛋白表达水平上调,恢复肠系膜脂肪形态,减少炎症侵润。结论:1、aP2-nSREBP1c转基因小鼠有脂肪萎缩、糖脂代谢紊乱、小肠增生和小肠糖吸收功能异常的表型。aP2-nSREBP1c脂肪代谢障碍模型小鼠肠系膜脂肪萎缩使其免疫屏障功能损失,诱导肠道机械屏障功能发生适应性变化。SREBPs信号可能参与到十二指肠葡萄糖传感和转运的调节机制中,而PPARγ信号通路与小肠增生或肠道机械屏障密切相关。2、肠道SGLTs-GLUTs与机体之间存在一种非饮食依赖的反馈调控机制以维持机体糖代谢稳态。在脂肪肝或脂肪萎缩的状态下,外周器官对葡萄糖的利用不足,机体保持高血糖状态,肠道SGLTs-GLUTs水平下调;机体对葡萄糖的利用增加可反馈上调肠道对外源性葡萄糖的摄取,上调肠道SGLTs-GLUTs水平。3、FTZ可改善aP2-nSREBP1c脂肪代谢障碍模型小鼠脂肪及肝脏的病理形态及功能以增加外周器官对机体的葡萄糖摄取与利用,通过机体与肠道的对话适应性改善肠道形态及糖吸收功能,达到综合改善糖脂代谢病的作用。
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