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《广东药科大学》 2019年
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广金钱草质量评价研究

陈亮元  
【摘要】:背景广金钱草为豆科山蚂蝗属植物广金钱草Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分,主产于我国广东、广西、福建等东南沿海地区。本品性凉,味甘、淡,具有清热除湿、利尿通淋之功效,用于治疗热淋、砂淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少、黄疽尿赤、尿路结石等症。广金钱草在岭南地区有着悠久的应用历史,也是著名凉茶“王老吉”的原料药材之一。目的《中国药典》(2015版)“广金钱草”项下,以对照药材和夏佛塔苷作为薄层鉴别的对照物质,以夏佛塔苷的含量限度作为控制药材质量的标准。鉴于中药化学成分复杂,单指标化学成分很难全面体现药材的品质,本研究针对广金钱草中的黄酮类化合物建立了多组分定性鉴别和定量分析的方法,同时对广金钱草多糖进行了化学组成分析和药理活性研究,为完善广金钱草质量标准、全面评价药材质量提供科学依据。方法1.在《中国药典》(2015版)的基础上优化广金钱草的薄层鉴别方法,通过对色谱条件(薄层板类型、展开系统、样品前处理方法、点样体积、点样方式、点样宽度、展距、温度、湿度等)的筛选以及方法学考察,建立广金钱草薄层色谱的鉴定方法。2.建立广金钱草黄酮类成分的HPLC分析方法,利用外标法测定了31批广金钱草药材和20批饮片中4种黄酮苷(夏佛塔苷、异荭草苷、异夏佛塔苷、异牡荆苷)的含量,同时建立了广金钱草药材和饮片指纹图谱,并且通过聚类分析、主成分分析和判别分析方法对31批广金钱草药材指纹图谱进行评价,同时比较外标法与“一测多评”法的实验结果,以验证“一测多评”法的准确性和可行性。3.对不同批次的广金钱草药材采用水提醇沉法制备粗多糖,采用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化HPLC法分析不同批次广金钱草多糖的单糖组成,优化水解时间、PMP反应温度、PMP反应时间等衍生化条件。同时,以阿卡波糖为阳性对照,初步探索广金钱草粗多糖体外对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果1.优化并建立了广金钱草薄层色谱的鉴定方法,即:取药材粉末0.5 g,加80%甲醇62.5 mL,超声提取20 min,过滤,回收甲醇,剩余提取液加入等体积乙酸乙酯-丁酮(1:1)溶液,萃取2次,合并萃取液,蒸干,残渣加50%甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。将供试品溶液点于同一硅胶GF_(254)薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:1:1:1)为展开剂展开,喷以1%AlCl_3试液显色后,置紫外灯(365nm)下检视。以维采宁-2、夏佛塔苷、异荭草苷、异牡荆苷为对照品,将31批广金钱草药材与12批饮片进行鉴别,供试品色谱在与对照药材和对照品色谱相应的位置上均具有黄绿色荧光斑点,并可与混淆品(金钱草、链荚豆、假花生)区分。2.采用Phenomenex Polar C_(18)柱,以乙腈作为流动相A,0.05%甲酸水溶液作为流动相B,进行梯度洗脱(0~20 min,13%~15%A;20~35min,15%A;35~60 min,15%~16%A),流速为0.8 mL/min,检测波长为335 nm,柱温为30℃,进样量为10μL,建立了广金钱草黄酮类成分的HPLC分析方法。同时建立了广金钱草药材和饮片的指纹图谱,标定了11个共有峰,指认了其中4个代表性成分,发现各批次药材和饮片的相似度范围分别为0.850~0.978和0.880~0.998,且化学模式识别方法的分类结果基本一致。此外,外标法和一测多评法的测定结果无差异。3.广金钱草多糖中主要含L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖,以及微量的D-甘露糖、D-木糖,各批次多糖的单糖组成基本一致。首次建立了广金钱草多糖的HPLC指纹图谱,供试品中除了广东梅州(S2’)、广西福绵(S10’)和广东高州(S19’)三份样品之外,各批次广金钱草多糖指纹图谱的相似度在0.824~0.981之间。同时,阿卡波糖的半数抑制浓度(IC_(50))为7.7601 mg/mL,广金钱草粗多糖的IC_(50)为0.7031 mg/mL。结论1.建立的薄层鉴定方法专属性强,重复性好,斑点条带清晰,分离度良好,可作为广金钱草药材及饮片的定性鉴别方法。2.建立了广金钱草黄酮类成分的HPLC指纹图谱,通过化学计量学分析方法对其进行综合评价。此外,成功建立了同时测定广金钱草四种黄酮苷含量的一测多评法,为广金钱草的质量评价提供参考。3.首次建立了广金钱草多糖的HPLC指纹图谱,且该方法稳定、简便、重复性好,可作为广金钱草多糖结构分析及其质量评价的依据。同时广金钱草粗多糖对α-葡萄糖苷酶具有明显的抑制作用,提示广金钱草多糖有降血糖的作用,但尚需后续的药效学实验证实。
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