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《广东药科大学》 2019年
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熊果苷治疗肝纤维化作用及机制研究

孙跃  
【摘要】:目的:纤维化在常见的多个器官和组织都有发生,是一种动态损伤修复的过程。部分受损的区域受到某一些促纤维化因子和促炎因子的刺激激活后合成分泌平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)到细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成纤维化。不同纤维化疾病的致病因素虽各不相同,但它们共同的特征均为肝星状细胞的活化和ECM的过度沉积。熊果苷(arbutin,Arb)又名熊果素,是一种葡糖衍生物,研究表明熊果苷有很好的抗炎效应。本论文旨在研究熊果苷对肝纤维化的药效作用并探讨其机制。方法:1、在动物水平上,我们选取SPF级的雄性C57小鼠(6周)随机分成三组:对照组、四氯化碳模型组和熊果苷给药组。其中熊果苷的给药剂量为50mg/kg。我们选择建立四氯化碳和胆道结扎两种经典肝纤维化模型来探究熊果苷在治疗肝纤维化方面的药效作用及相关机制。CCl_4腹腔注射持续6周(CCl_4:Oil=1:4),BDL采取双侧胆道结扎模型造模15天,造模的同时给与熊果苷药物进行治疗。2、样本取材及生化指标分析:造模结束后对小鼠进行血清取样检测和组织肝脏的提取。通过相关肝功能血清指标:丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)进行初步活性分析判断。3、小鼠肝组织主要分为两大部分:一部分用作形态学分析通过对病理实验的观察统计鉴定纤维化程度和药物效应。另一部分的肝组织用在蛋白、mRNA等分子实验,检测其分子水平上的一些趋势变化进而确定熊果苷治疗肝纤维化潜在的分子机制。4、在细胞水平上,在适宜环境下培养人源的肝星状细胞株(LX-2)分别给予不同药物浓度的熊果苷药物并对其机制做初步探究。结果:1、四氯化碳(CCl_4)和胆道结扎模型(BDL)生化血清指标结果显示两种模型的ALT水平较对照组而言均有显著的升高,此数据证实了纤维化模型的成功的建立。在给与熊果苷药物治疗后,给药组ALT水平显著降低相比较模型组并具统计学意义。BDL诱导的纤维化模型中,熊果苷给药组有显著下调趋势相比模型组的两个血清指标:总胆红素(total bilirubin,TBIL)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)具有统计学意义。此结果均说明熊果苷可以有效减缓两种不同肝纤维化模型诱导的肝损伤。2、病理实验结果表明:和对照组相比,在显微镜下观测苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staning,HE)和天狼星红染色(Sirius Red)病理片。与对照组而言,模型组出现大量的炎症浸润以及部分肝细胞的坏死,正常肝小叶结构丧失,周围出现大量的胶原沉积。熊果苷给药组对于模型组而言炎症和坏死的细胞数量明显减少,汇管区胶原纤维之间的桥连有所改善。3、免疫组化统计结果显示:肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)标志物的激活Marker为α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)。结果显示给药组对比模型组有明显的减轻。同时在蛋白水平通过Western Blot检测α-SMA的蛋白表达,进一步确认熊果苷可以有效抑制HSCs的活化,减少胶原的合成。4、通过免疫荧光(immunofluorescence,IF)和荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,QPCR)检测巨噬细胞标志物F4/80,发现和模型组相比熊果苷给药组中的F4/80表达明显减少。随后又通过QPCR检测炎症相关指标:单核细胞趋化蛋白1(Kit for Monocyte Chemotactic Protein 1,MCP-1)、致纤维化因子:基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1,TIMP-1)的mRNA水平变化证明熊果苷通过减轻炎症抑制肝纤维化进展,进一部探究其作用机制。5、在细胞水平上,我们发现LX-2细胞中加入不同浓度的熊果苷后HSCs的α-SMA表达以及p-Smad3、p-Akt均明显下调。结果初步表明熊果苷可以通过参与p-Akt/Akt和Smad3信号通路抑制肝纤维化作用。结论:熊果苷通过抑制肝星状细胞的活化从而减轻肝纤维化。
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