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《广东药科大学》 2019年
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丹酚酸B-TAT脂质体的制备及其抑制HSF增殖研究

吴艳婷  
【摘要】:研究背景增生性瘢痕(Hypertrophic scars,HS)是一种临床常见但治愈率低的皮肤纤维化疾病,目前以手术和药物注射治疗为主。HS手术治疗复发率较高,会给患者带来痛楚,激素类药物注射给药副作用较大且费用相对昂贵。因此,研制出有效预防与治疗HS的潜在新型药物具有重要意义。人皮肤成纤维细胞(Human Skin Fibroblasts,HSF)是HS形成的关键效应细胞。研究认为HSF过度增殖、活化和分化成肌成纤维细胞(Human Myofibroblasts,HMF),是HS病理生理学的中心环节。丹酚酸B(Salvianolic acid B,SAB)具有明显的抗纤维化作用,能抑制成纤维细胞增殖及胶原合成,作用于TGF-β/Smads等多个信号转导通路。穿膜肽TAT是一种新型促进药物转运的佐剂,具有高度细胞穿透能力,能转运药物透过皮肤,促进药物跨膜转运而不改变转导物质生物活性或造成细胞膜伤害。本课题拟将合成的DSPE-PEG_(1000)-TAT作为导向性材料,制备载丹酚酸B的穿膜肽TAT修饰脂质体(SAB-TAT-LIP)透皮制剂,使脂质体具有高效的入胞能力,高效透过皮肤角质层屏障,增强真皮层的药物递送和细胞摄取,从而发挥防治HS的作用。目的研制SAB-TAT-LIP透皮制剂,优化制备工艺,进行质量考察;考察其体外透皮性能、真皮层滞留效应及皮肤刺激性和致敏性;同时,考察其对体外HSF的增殖、迁移、侵袭、TGF-β_1表达水平、细胞周期与凋亡等生物学特性的影响,为SAB透皮给药系统的研究提供新的思路和方法。方法(1)DSPE-PEG_(1000)-TAT磷脂导向性材料的合成与表征。将DSPE-PEG_(1000)-MAL和末端含有半胱氨酸的穿膜肽TAT通过迈克尔加成法合成DSPE-PEG_(1000)-TAT,采用MALDI-TOF-MS法对终产物进行分子量鉴定,FT-IR和~1H-NMR法进行结构鉴定。(2)SAB-TAT-LIP的制备工艺研究。建立SAB的HPLC含量测定方法;以DSPE-PEG_(1000)-TAT作为磷脂导向性材料,采用pH梯度-逆向蒸发法制备SAB-TAT-LIP,以包封率为评价指标,单因素试验筛选出显著因素,在此基础上采用Box-Behnken响应面法优化脂质体的制备工艺,并进行最优工艺的验证。(3)SAB-TAT-LIP的质量评价。考察脂质体形态,粒径,Zeta电位,载药量,初步稳定性和冻干稳定性等理化性质;采用动态透析法考察脂质体的体外释药规律;采用改良Franz扩散池法考察脂质体的体外透皮性能,真皮层滞留效应,并绘制体外渗透曲线,拟合药物动力学方程;进行皮肤刺激性和致敏性考察,观察皮肤有无红斑及水肿现象,同时将给药部位的皮肤组织进行HE染色,综合评价该脂质体透皮制剂的安全性。(4)SAB-TAT-LIP对HSF增殖等细胞生物学特性的影响。建立HSF传代培养、冻存和复苏方法;考察SAB-TAT-LIP的体外血清稳定性,并采用MTT比色法考察不同浓度SAB-TAT-LIP对HSF增殖活性的影响,设计合理的给药浓度;采用Transwell小室法和划痕法考察脂质体对细胞侵袭和迁移能力的影响;采用流式细胞术考察脂质体对细胞凋亡和细胞周期的影响;采用双抗体夹心酶联免疫吸附ELISA试验检测脂质体对TGF-β_1表达水平的影响。结果(1)对比反应物和终产物的MALDI-TOF-MS、FT-IR和~1H-NMR图谱,结果验证所得的终产物为目标化合物,成功合成了DSPE-PEG_(1000)-TAT磷脂材料,可用于下一步实验。(2)SAB-TAT-LIP最优制备工艺为:取处方量的S100,Chol,DSPE-PEG_(1000),DSPE-PEG_(2000),DSPE-PEG_(1000)-TAT(100:33.33:2:1:1,mol/mol)溶于有机溶剂(氯仿:甲醇=2:1,v/v),SAB溶于1%甘氨酸-盐酸缓冲盐溶液(pH值为3.28),将两相体系转移入茄形瓶中,置于旋转蒸发仪中旋干有机溶剂,在氮气氛围下放置过夜吹干残留的有机溶剂,加入适量的PBS缓冲盐溶液调至pH值为6.0,继续孵育30 min形成脂质体乳液,探头超声180次(功率300 W,超1 s间隔1s),过0.8μm的微孔滤膜,然后用400 nm脂质体挤出仪来回挤出15次整粒,即得SAB-TAT-LIP。测得该脂质体载药量为(6.31±0.34)mg·mL~(-1),包封率为(86.70±0.85)%。处方量扩大5倍后,测得载药量为(6.27±0.51)mg·mL~(-1),包封率为(86.22±0.97)%。结果表明制备工艺稳定可靠。(3)SAB-TAT-LIP大小较均匀,呈球状或近球状,分散性较好,平均粒径为(219.90±5.09)nm,Zeta电位(-9.25±0.92)mV,多分散系数PDI值为0.190±0.013,4℃放置10 d稳定性良好;脂质体冻干粉复溶后形态和包封率无明显变化,分布均匀,粒度圆整;体外24 h累积释放率为62.49%,无突释效应,具有明显的缓释作用,符合Hixon-crowell方程模型;体外32 h皮肤累积透过率为17.21%,透过速率为(28.33±4.9)μg?cm~(-2)?h~(-1),真皮层滞留量为(44.39±6.87)μg?cm~(-2),符合零级方程及Hixon-crowell方程模型,体外透皮性能明显优于SAB溶液和SAB普通脂质体,且无皮肤刺激性和致敏性。(4)体外培养的HSF生长状况良好,符合实验要求;SAB-TAT-LIP在血清环境中24 h内无明显聚集和沉淀现象,粒径大小和吸光度值无明显变化,稳定性较好;空白脂质体对HSF基本无毒副作用,不同浓度的SAB-TAT-LIP干预HSF不同时间后,均具有一定的增殖抑制作用,且呈现剂量和时间依赖性,同时细胞迁移和侵袭能力明显降低;SAB-TAT-LIP干预HSF 48 h后,可使细胞周期阻滞于G_0/G_1期,细胞早调和中晚调率明显增加,TGF-β_1分泌量显著降低,与空白对照组相比,差异具有统计学意义。结论Box-Behnken效应面法优化得到的SAB-TAT-LIP包封率较高、粒径较小,体外释放和透皮行为均满足局部透皮给药制剂的体外释放和透皮规律,对体外HSF的增殖、迁移和侵袭具有显著的抑制作用,对细胞凋亡有促进作用,对细胞周期G_0/G_1期有阻滞作用,对TGF-β_1的表达水平有下调作用,为后期用于研究体内防治HS及其作用机制奠定了基础。
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