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《广东药科大学》 2019年
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黄独素B诱导小鼠肝损伤代谢组学及肠道菌群研究

巫圣乾  
【摘要】:本研究采用基于核磁共振(~1H-NMR)和气相色谱-飞行时间质谱联用(GC-TOFMS)的代谢组学研究技术,并使用16S rRNA高通量测序法的肠道菌群技术对黄独素B诱导小鼠肝损伤进行研究,从代谢网络和肠道菌群角度探讨黄独素B诱导小鼠肝损伤作用机制,为黄药子的毒性研究提供新的实验证据。主要研究内容如下:第一部分黄独素B毒性评价将小鼠分为黄独素B组与正常组,黄独素B组连续灌胃给药黄独素B混悬液(150 mg/kg,给药前以0.5%CMC-Na溶液制成10mg/mL的混悬液)14d,正常组小鼠灌胃等体积0.5%CMC-Na溶液,末次给药24 h后,检测小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平和肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;采用苏木精-伊红染色法观察肝组织病理学变化。结果显示:(1)与正常组对比,黄独素B组小鼠血清ALT、AST及肝组织MDA水平升高,肝组织SOD水平下降。(2)正常组小鼠肝组织细胞边界清晰、排列整齐、形态正常,均未见组织病理学异常;黄独素B组小鼠肝组织细胞出现脂肪变性,部分细胞出现水肿,肝组织病理学改变较明显。第二部分基于~1H-NMR技术的黄独素B诱导小鼠肝损伤的代谢组学研究将小鼠尿液、粪便和肝脏样本进行代谢组学技术前处理,使用~1H-NMR技术测定代谢物轮廓;采用正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least-Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)研究黄独素B诱导小鼠肝损伤代谢表型变化;运用变量重要性投影(Variable Importance in the Projection,VIP)和t检验筛选潜在生物标志物。结果表明:(1)黄独素B能引起的小鼠尿液、粪便和肝脏代谢表型紊乱,表现为尿液中筛选出8个生物标志物(丙酮、丙酮酸、α-酮戊二酸、牛磺酸、甘氨酸、苯乙酰甘氨酸、马尿酸、吲哚硫酸酯)、粪便中筛选出9个生物标志物(胆汁酸、丙酸、谷氨酰胺、乳酸、苏氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、苯丙氨酸),肝脏中筛选出7个生物标志物(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、乙酸、谷氨酸、胆碱)。(2)黄独素B诱导小鼠肝损伤主要涉及四个方面:三羧酸循环、氨基酸代谢、肠道菌群代谢、神经系统异常。第三部分基于GC-TOFMS技术的黄独素B诱导小鼠肝损伤的代谢组学研究利用GC-TOFMS技术测定小鼠血清代谢物轮廓;采用OPLS-DA研究黄独素B诱导小鼠肝损伤引起的代谢表型变化;通过VIP和t检验对与黄独素B诱导小鼠肝损伤相关潜在生物标志物进行筛选。结果表明:(1)筛选出7个与黄独素B诱导小鼠肝损伤相关的潜在标志物(α-酮异戊酸、尿囊素、亚牛磺酸、己酸、D-苏糖醇、蔗糖、戊二酸)(2)黄独素诱导小鼠肝损伤可能与能量代谢异常、氧化应激、脂质过氧化、肠道菌群代谢及氨基酸代谢相关。第四部分基于16S rRNA高通量测序的黄独素B诱导小鼠肝损伤肠道菌群研究采用16S rRNA高通量测序技术对小鼠粪便肠道菌群结构与组成的变化进行研究。使用双末端测序(Paired-End)法进行小片段文库的构建,Illumina HiSeq测序平台进行测序;拼接过滤Reads后进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类,并利用分类学数据库对OTU进行物种注释及丰度分析;通过PCoA及LEfSe分析对潜在菌群标志物进行判别。结果表明:(1)黄独素B能引起小鼠肠道菌群结构发生变化。(2)门、科及属水平总共筛选出11种潜在菌群标志物,提示黄独素肝损伤机制与短链脂肪酸代谢,胆汁酸代谢及胆汁酸重吸收有关。
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