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《广东药科大学》 2019年
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蜜炙黄芪多糖的制备及对DSS诱导结肠炎小鼠的影响

李婵艺  
【摘要】:中医理论认为黄芪经蜜炙后可增强其补中益气的功效,前期研究表明黄芪蜜炙前后的药效差异与其主要化学成分的结构变化密切相关。活性多糖是黄芪中一类十分重要的水溶性成分,黄芪蜜炙后是否是由于多糖成分结构改变从而提高药效并未见报道。本研究通过对蜜炙黄芪多糖及黄芪多糖分离纯化、结构表征,并考察两者对DSS诱导的结肠炎小鼠模型的影响探讨其发挥疗效的潜在机制,为黄芪炮制机理的研究奠定基础。方法:蜜炙黄芪与黄芪分别经水提醇沉、木瓜蛋白酶酶解、Sevage除蛋白、透析后分别得到粗多糖HAPS和APS,再分别依次用DEAE-52层析柱、HW-65F层析柱分离得到HAPS3a和APS3a。利用化学手段(苯酚硫酸法、完全酸水解)和色谱(HPLC-GFC-ELSD、UPLC/Q-TOF-MS)技术测定HAPS3a和APS3a的糖含量、分子量、单糖组成及比例等。建立DSS诱导的结肠炎小鼠模型,分别经口服灌胃200 mg/kg的HAPS、APS、HAPS3a与APS3a,从体重变化、结肠长度、结肠组织切片及检细胞因子的表达量综合评价其抗炎活性。应用16S RNA测序技术结合生物信息学测定、分析小鼠粪便中菌群的相对丰度,采用气相色谱法测定小鼠粪便样品中的总SCFA、乙酸、丙酸及丁酸的含量。采用UPLC-Q/TOF-MS检测小鼠的血清代谢物变化,通过多元统计学分析找出潜在的生物标记物,并进行相关代谢通路分析。结果:经本法分离纯化得到HAPS3a和APS3a的糖含量分别为89%、87%,其分子量分别为3,388 kDa、2,781 kDa。两者的单糖组成均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖/木糖、岩藻糖,相应的摩尔比分别为0.16:3.26:0.12:2.73:0.43:6.67:12.93:0.49和0.17:3.88:0.20:4.92:0.72:3.62:12.88:0.40。HAPS、APS、HAPS3a与APS3a均可减缓结肠炎小鼠模型的体重降低、脾脏指数降低,且增加结肠长度、缓解结肠隐窝破坏及肠腔溃烂,显著降低结肠组织中IL-1β的表达量,其中HAPS3a与APS3a具有更佳的抗炎作用。HAPS3a能降低结肠炎小鼠模型肠道中厚壁菌门与拟杆菌门丰度比值,并增加乳杆菌属丰度,而APS3a降低疣微菌门丰度。此外,HAPS3a与APS3a能够增加总SCFA,HAPS3a主要增加乙酸、丙酸的含量,APS3a主要增加丁酸含量。代谢组学研究筛选出HAPS3a与APS3a干预结肠炎小鼠模型的生物标记物分别为27、25个,主要为磷脂酰胆碱类,溶血磷脂酸胆碱类和花生四烯酸代谢相关产物。HAPS3a主要影响的代谢途径为花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和甘油磷脂酸代谢,而APS3a主要影响脂肪酸的合成、亚油酸代谢和甘油磷脂酸代谢途径。结论:成功从蜜炙黄芪与黄芪中分离纯化出百万级的大分子量多糖HAPS3a与APS3a,二者在分子量、单糖组成比例方面存在一定差异,且均能通过保护肠道黏膜、影响细胞因子表达和菌群多样性而发挥抗炎活性作用,但是两者所影响的代谢途径存在一定差异:前者主要影响花生四烯酸代谢途径,后者主要影响脂肪酸代谢途径。活性多糖HAPS3a与APS3a的化学结构及抗炎活性作用的差异,可能与黄芪经蜜炙后多糖结构发生了改变从而影响了活性作用有关。
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