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农杆菌介导的蓝猪耳(Torenia fournieri Lind.)和松叶牡丹(Portulaca grandiflora Hook.)遗传转化研究

禹艳红  
【摘要】: 利用基因工程改良花卉颜色,已经成为观赏植物品质育种中的重要内容。本研究构建了包含非洲菊查尔酮合成酶反义基因的植物表达载体,并利用冻融法导入了根癌农杆菌LBA4404,得到了工程菌。以蓝猪耳为主要研究对象,建立了高效的蓝猪耳离体再生体系,并以蓝猪耳叶片为转化材料,用带有目的基因的农杆菌感染建立了蓝猪耳的遗传转化体系。同时以松叶牡丹的叶片和愈伤组织为感染材料,也进行了遗传转化研究。分别得到了在选择培养基上生长的抗性植株。 对于蓝猪耳的愈伤组织诱导而言,不同外植体类型之间存在很大的区别。不同的外植体中,以带有根系的材料的诱导率高。以叶片为外植体直接诱导出芽发现,在MS+NAA0.1mg/L+6-BA2mg/L上有较高的不定芽诱导率,以MS+NAA0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的激素组分有较高的不定芽诱导数。添加少量的NAA就可得到较多的不定根。 在得到高效的蓝猪耳再生体系和带有外源目的基因的工程菌的条件下,对蓝猪耳进行遗传转化研究。在不同的出芽培养基上,卡那霉素的选择浓度也不同,出芽率越高,卡那霉素所需的浓度越高。在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L上,300mg/L的卡那霉素(Kan)才能抑制不定芽的形成。头孢毒素(Cef)对不定芽的诱导有一定的抑制作用,哌拉西林钠(Pip)对不定芽的诱导抑制作用稍弱,以Pip400mg/L作为抑菌生长浓度。在对影响转化效率的因素的研究中发现用蓝猪耳叶盘法进行转化时采用整叶用超声波直接处理效果较好,可减少叶片色损伤,而且超声波的处理时间不宜太长,以2s为宜。在菌液中添加AS可以提高GUS基因的瞬时表达。预培养2d后共培养6d,可以明显增加GUS基因的瞬时表达和不定芽的形成。 对松叶牡丹进行遗传转化研究发现,采用叶片作为外植体时,Kan的浓度100mg/L就可抑制愈伤的诱导,而用愈伤组织作为材料感染时浓度要达到200mg/L才可。二种外植体的转化效果存在很大的差别,以愈伤组织的GUS瞬时表达和抗性愈伤得率高。进行6d的共培养可明显的提高二者的转化效率,同时采用适当的伤口处理如超声波处理2~4s对二者的转化也有很大的影响。菌液浓度和侵染时间对二者抗性愈伤得率有明显的影响。


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