发根农杆菌对蓝猪耳的遗传转化及其毛状根再生植株的初步研究

【摘要】： 本实验研究了(1)发根农杆菌的生理生化、分子生物学鉴定及生物检测和活力比较；(2)发根农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化和蓝猪耳毛状根的植株再生，为蓝猪耳的遗传转化和其它分子生物学研究奠定基础。 采用3-酮乳糖产物法、差异酸生成实验和游动性实验鉴定6种发根农杆菌供试菌株A4、R1205、R1000、R1601、R1022和15834。结果表明R1205、R1601、R1000和A4为Ⅱ型农杆菌，其活力大小依次是R1000，R1205，A4，R1601。R1022和15834不是Ⅱ型菌。通过不同培养时间下菌液的浓度测定表明，所有测试菌株均在16—32h时呈现对数生长，培养32h时的菌液浓度为R1000＞R1205＞R1601＞R1022＞A4＞15834，但培养40h时A4菌液浓度达到最大。利用PCR方法鉴定结果表明，所有供试菌株中，A4、R1205、R1000和R1601为含Ri质粒的发根农杆菌，而R1022和15834未出现阳性结果。利用黄瓜作为菌株遗传转化率鉴定的模式系统来研究A4，R1205，R1000，R1601活力，结果表明R1000的遗传转化率最大，达到79.16％，其余依次是R1205、R1601和A4。 R1000、R1205、R1601和A4转化蓝猪耳形成的根PCR和Southern blot检测表明，除R1205转化形成的根的一个克隆外，所有的毛状根克隆都呈现PCR阳性。在PCR检测阳性的克隆中，随机挑选2个做Southern blot，结果均呈阳性。 不同菌株对蓝猪耳的遗传转化能力不同，R1000和A4明显高于R1205和R1601。蓝猪耳遗传转化的最适菌液OD_(600)值为1.0(6×10~7个细菌／ml)。2～3天共培养有利于蓝猪耳的遗传转化，10～30．M外源乙酰丁香酮能有效地提高毛状根的形成率，但是在高于40．M时，转化 率不能显著提高。4m幼以下的硝酸银便能有效地提高遗传转化率，但 高剂量(10m幼)时作用却相反。预培养和共培养培养基pH从4.5提 高到6.5时，毛状根诱导率显著提高，但是当提高到7.5时，诱根率却 显著下降。在最适转化条件下，发根农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化率可 达90%， 经Klll筛选的蓝猪耳毛状根扩大培养7天后切下转入诱芽和诱导愈 伤组织培养基中，3周后没有发现愈伤组织形成。培养3周后在1/2 Ms+4一Pul.0培养基上大约2.5%毛状根形成芽。芽经过250m幼Km抗 性筛选28天后86.7%的再生芽能在抗性培养基上存活，但生长不明显。 筛选后的芽在1/2 MS+NAAO.1培养基上生长40天后无根形成，并且6 株芽中2株黄化死亡，其余4株高度不到2 cm。存活的4株芽转至1/2 MS+GAI.0培养基上，28天后芽仍无明显生长。