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根癌农杆菌介导的P_(SAG12)-IPT基因转化蓝猪耳的研究

林少岩  
【摘要】:蓝猪耳(Torenia fournieri L.)是一种重要的热带、亚热带观花植物,盛花期较长,且具备特殊的裸露胚囊,是一种研究植物花器官发育和授粉受精过程的理想模式植物。嵌合基因P_(SAG12)-IPT由来源于拟南芥的衰老特异表达的启动子SAG12与来源于农杆菌质粒的致瘤基因区(tmr)的编码细胞分裂素合成酶的基因(异戊烯基转移酶ipt)组成,常用于转化植物以提高被转化植物抵抗衰老的能力。 本研究利用限制性内切酶XbaⅠ消化双元载体pCAMBIA1301和载体pSG516并连接然后转化大肠杆菌DH5α最终得到的双元表达载体pHQIPT,含目的基因P_(SAG12)-IPT、GUS报告基因、Hygromycin抗性基因。用冻融法将其导入了根癌农杆菌EHA101。 本研究以在组培苗蓝猪耳叶片为外植体,在共培养基中与根癌农杆菌EHA101~(pHQIPT)共培养4d后,GUS瞬时表达检测90%的外植体为阳性。叶片外植体在诱芽培养基(Cef500mg/L,Hyg15mg/L)上筛选20d后移到生根培养基(Cef500mg/L,Hyg0mg/L)上培养15d,然后再移到生根培养基(Cef500mg/L,Hyg15mg/L)上筛选20d即可得到GUS染色检测为阳性的抗性芽。GUS染色检测、PCR检测、Southern blot、Northern blot确定九株抗性株为转基因植株。九株转基因株与对照的形态有所不同,表现为侧芽的无限增殖,叶片小且卷曲、根少且短,类似于细胞分裂素的过量表达。推测蓝猪耳幼苗中具有激活SAG12特异启动子的反式作用因子,使得IPT基因过量表达所致。


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