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《华南师范大学》 2007年
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光动力学诱导细胞凋亡机制的研究

万清玲  
【摘要】: 细胞凋亡是机体生命活动中重要的细胞学事件,在许多疾病的治疗中起着关键性作用。光动力学疗法(PDT)是一种治疗癌症的新技术,凋亡是PDT作用引起的主要死亡方式,但PDT诱导的细胞凋亡机制目前还不明确。本论文利用激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)结合荧光共振能量转移技术(FRET)研究PDT诱导细胞凋亡的分子机制。该研究进一步阐明PDT作用的生物效应及其机制,并对PDT更好地应用于临床具有重要的指导意义。 本论文在充分调研国际、国内有关PDT凋亡研究进展的前提下,首先概述了有关光动力疗法的基本知识以及治疗肿瘤的机制,接着总结了细胞凋亡相关蛋白的基本信息以及细胞凋亡通路的调节,然后对激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的原理和应用进行了概况性的介绍。 本论文分三个部分详细介绍了实验工作: 在第一部分的实验工作中,我们利用siRNA技术检测Bid蛋白在NPe6-PDT诱导细胞凋亡过程的作用。研究结果表明:Bid蛋白沉默后,NPe6-PDT诱导的细胞死亡明显地被抑制。同时利用FRET技术和荧光成像技术检测Bid蛋白切割和转位线粒体的动态变化。研究结果表明:NPe6-PDT引起Bid的切割,此过程发生在处理后150min,历时45min。Bid被切割活化后会发生空间移位,即从胞浆内转位到线粒体,此过程历时45min。上述实验结果表明Bid在NPe6-PDT诱导的细胞凋亡中起到很重要的作用。 在第二部分的实验工作中,我们主要利用FRET技术和荧光成像技术对NPe6-PDT诱导的细胞凋亡信号通路进行了研究。在NPe6-PDT诱导人类肺腺癌细胞(ASTC-a-1)凋亡的过程中,用溶酶体荧光探针确定NPe6在ASTC-a-1细胞的亚细胞定位;用基于Bid-FRET和SCAT-3荧光基因报道探针的FRET技术来检测细胞内Bid和caspase-3的活性;用Ctyc-GFP荧光基因报道探针来检测细胞中细胞色素C的释放。这些荧光成像技术的使用实现了细胞内生命事件在体实时定位的动态观测。结果发现NPe6定位到溶酶体膜上,由于光敏作用导致的损伤主要发生在光敏剂结合位点附近几个纳米的范围内,因此溶酶体为NPe6-PDT诱导凋亡的最初作用靶点。实验结果表明NPe6-PDT诱导细胞凋亡过程中发生了一系列级联事件:NPe6-PDT处理后,Bid的切割和转位大概发生在150min左右,细胞色素C大概200min从线粒体释放到胞浆,caspase-3大概在240min发生活化。该研究有助于深化对NPe6-PDT抗肿瘤作用机理的认识,为临床治疗提供新的理论参考依据。 在第三部分的实验工作中,运用荧光成像技术单细胞水平上实时监测线粒体介导的PDT和溶酶体介导的PDT诱导的细胞凋亡过程中Bax的活性。实验结果显示:未经任何处理的细胞中Bax荧光分布在整个细胞;经Photofrin-PDT处理的细胞,荧光蛋白Bax-GFP 15min转位到线粒体,而且整个转位过程只需要45min。而在NPe6-PDT处理的细胞,荧光蛋白Bax-GFP没有发生转位。结果表明不同定位的光敏剂所介导的PDT作用对Bax的活性影响不一样。
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