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《海南大学》 2011年
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巴西橡胶树体胚发生的改良及乳管分化研究

谭德冠  
【摘要】:巴西橡胶树属大戟科橡胶属,是多年生的异花授粉乔木,在热带地区广泛种植。其所产的天然橡胶是四大工业原料之一,也是重要的战略物资,在国民经济中占有举足轻重的地位。巴西橡胶树花药培养是其遗传改良的重要技术手段,但体胚发生频率低是制约其组培苗工厂化生产和构建遗传转化体系的主要因素。本研究主要围绕如何改良巴西橡胶树花药体胚发生来开展一系列工作。我们对影响花药培养体胚发生的内外因素进行深入研究并对其培养条件进行改良;由于游离小孢子培养具有提高胚胎发生的优点,我们尝试在橡胶树开展这方面的工作;转基因技术是遗传改良的重要技术手段,我们克隆了胚胎发生关键基因并转化橡胶树的花药愈伤,以期获得具高体胚发生能力的转基因株系;我们首次发现花药愈伤中存在乳管细胞,探讨花药愈伤乳管细胞分化与体胚发生关系,对改良体胚发生也有一定的意义。上述这些研究的开展,将对提高橡胶树花药体胚发生和改良其花药培养有着重要的意义。本研究所取得的结果如下: (1)首次系统研究了橡胶树花药愈伤的形态特征、组织细胞学区别。橡胶树花药胚性与非胚性愈伤有着明显差别,前者表现为组织疏松脆性,表面凹凸不平,有较多小球状突起,细胞中含有较大的胞核,细胞形状呈规则小圆球形,细胞排列紧密,细胞体积较小;后者存在两种类型,第一种表现为结构紧密,整块组织硬实,表面较平滑,细胞形态不规则,胞质稀少,部分细胞含有极小的胞核,细胞体积大,第二种表现为组织松软、水渍状,细胞不含有胞核,胞质极稀薄并液泡化,细胞形状不规则,细胞排列较疏松,胞间间隙较大,细胞体积较大。同时发现胚性愈伤发生频率与其体胚发生频率呈极显著相关;胚性愈伤在培养后期细胞合成依然保持活跃,细胞分裂依然旺盛,细胞分化力高。 首次对橡胶树花药胚性愈伤胚胎发生的生理生化机制进行深入研究。同一品种的胚性愈伤在整个培养过程中淀粉和蛋白质含量均高于非胚性愈伤,在培养后期开始积累淀粉,可能是为体胚发生作准备,为新的发育阶段提供物质和能量。胚性愈伤高含量的蛋白质可能是其体胎发生的关键因素。胚性愈伤中类胡萝卜素含量较高,表明其具有较强的抗氧化能力,使其细胞不易褐化,降低了组织块的褐化程度。高体胚发生频率的品种其胚性愈伤细胞代谢较活跃,分化力较强,从而消耗更多的碳源,同时这种碳源的消耗可能是促进其向胚胎发生的信号。胚性愈伤CAT、SOD的含量与体胚发生频率呈极显著相关,CAT、SOD可能是胚性愈伤体胚发生的基础。 (2)对橡胶树花药体胚进行系统分类,共分9种类型;首次发现橡胶树花药体胚发生过程中产生双体胚现象,该类胚能正常发育成植株。 对橡胶树花药体胚发生的培养条件进行改良。暗培养诱导胚状体2个月后再转移至500Lux弱光照条件下培养10-15d,然后再转移至出苗培养基培养,能够显著提高植株再生率;稀土具有提高橡胶树花药体胚发生率的效果,诱导胚胎发生培养基中以添加1mgL-’稀土培养效果最佳。 (3)对橡胶树游离小孢子培养体系进行初步研究。小孢子的提取采用两种不同的方法进行,结果发现以间接研磨法为佳,虽然工作效率低,但污染率低、杂质少、培养效果好。对小孢子进行不同的预处理试验,发现用Starvation Medium B预处理液预处理小孢子2d有利于小孢子分化。比较两种不同的碳源培养效果,发现麦芽糖培养效果好。对诱导培养基中的pH值、组分进行研究,发现诱导培养基pH值为6.6时,以改良N6为基本培养基添加外源激素2,4-D 0.5 mgL-1、KT 0.5mgL-1诱导效果好,小孢子分化率达8.33%。巴西橡胶树游离小孢子分化依赖基因型,只有海垦2的小孢子具有分化力。小孢子的分化以B途径为主,初步获得小孢子分化的细胞团和微愈伤。同时以橡胶树小孢子为受体进行电激转化试验,瞬时表达结果证明外源基因已导入部分小孢子基因组中。 (4)以橡胶树品种海垦2花药愈伤为受体,采用农杆菌介导法将胚胎发生基因BabyBoom转化橡胶树。结果表明:卡那霉素选择压以50mgL-1为最佳;共培养温度对转化效率影响显著,以20℃共培养效果较26℃好;侵染培养35-40d的愈伤转化效率最高,达100%。获得了抗性愈伤和转基因胚状体,经GUS组织化学法和PCR检测,表明外源基因已整合至它们的基因组中,为下一步转基因植株的获得奠定了基础。 (5)通过组织化学法和免疫组织化学法首次证明巴西橡胶树花药愈伤中存在乳管细胞,虽然花药愈伤中存在少数的延伸形态的乳管细胞,但大部分表现为非延伸形态,不同于植物中现有的乳管细胞形态。这些非延伸形态的乳管细胞可能是有节乳管早期的原始特征。 乳管细胞在花药愈伤中的分化依赖基因型,同时与体胚发生负相关。R107、RRIM600、热研8-79、热研7-33-97较海垦2有着更多的乳管细胞,但体胚发生率均显著低于海垦2。乳管细胞簇在PR107、RRIM600、热研8-79、热研7-33-97的愈伤中存在,但未能在海垦2花药中发现。这表明愈伤组织中的乳管细胞妨碍其体胚发生。如果能通过改良培养条件(激素调控等)来减少愈伤组织中乳管细胞数量,以期提高其体胚发生力,则有可能克服花药培养难题,这可能提供了一个改良橡胶树组织培养的连接点。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:B
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S794.1

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