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《海南大学》 2011年
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橡胶树亚硝酸还原酶基因的克隆及其功能初步鉴定

董军美  
【摘要】:天然橡胶的主要来源是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis),巴西橡胶树早在20世纪70年代就已实现通过体细胞胚状体发生途径再生植株,但到目前为止植株再生频率仍然较低且只有少数无性系能够实现体外形态发生。橡胶树的离体培养难度大是进行基因工程育种的主要障碍。离体培养的主要问题之一就是组培愈伤褐化问题。现已有很多的研究证明亚硝酸还原酶(nitrite reductase)是影响愈伤组织生长状态、分化再生植株能力的主效基因[Nishimura A et al.2005]。因此克隆橡胶树的NiR基因并对其进行表达和酶活性分析,研究其跟橡胶树愈伤组织再生能力的相关性具有重要的理论意义和和应用前景。 本论文首次对巴西橡胶树中亚硝酸还原酶基因进行了克隆并对其组织表达特性及粗酶活性进行了初步分析。本文主要研究结果如下: 1.本研究以巴西橡胶树胶乳RNA反转录后的cDNA为模板,根据水稻、蓖麻、大蓟等亚硝酸还原酶的保守区段设计兼并引物,首先克隆橡胶亚硝酸还原酶基因保守片段,再设计两端RACE引物,使用RACE手段获得两端片段,首次克隆了橡胶亚硝酸还原酶基因的完整cDNA,全长1462bp,命名为HbNIR; 2.序列分析表明:HbNIR具有完整的开放阅读框,编码一个长度为390个氨基酸的蛋白,包含亚硝酸盐/亚硫酸盐还原酶家族保守结构域,与大戟科蓖麻cDNA匹配度为88%。定位于细胞质的最大可能性为45%,定位于过氧化物酶体的最大可能性为30%; 3.半定量PCR结果表明:HbNIR基因在橡胶不同组织中表达差异较大,叶片中高效表达,根与花次之,皮与胶乳中表达最弱; 4.将HbNIR基因导入pGEX-6p-1表达载体,实现了HbNIR基因在E. coli中的高效表达。预计编码产物大小为43.9kD,经1 mmol/LIPTG诱导后可表达大小约为70 kD的蛋白(含约26 kD的GST标签),具有明显的还原酶活性。 本文研究,首次获得了亚硝酸还原酶基因,并初步进行了粗酶活性等功能鉴定。研究发现该还原酶在同一株橡胶树不同组织表达差异显著;对底物亚硝酸盐具有较明显的消化作用。本文结果,对进一步明确亚硝酸还原酶在橡胶中的作用奠定了良好基础,具有理论意义和应用前景。
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