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《海南大学》 2011年
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拮抗香蕉枯萎病菌的LX1菌株的分离鉴定及其抑菌蛋白的分离纯化与该基因的克隆

卢娟  
【摘要】:香蕉枯萎病的发生和流行,严重地威胁着香蕉产业的发展。鉴于长期使用化学药剂会造成环境污染及病虫害抗药性的产生等一系列问题的出现,而选育抗病品种也有着技术等种种困难,因此,生物防治成为环保、安全有效的防治香蕉枯萎病的途径。本研究目的从海南盐碱地土壤样品中筛选出对香蕉枯萎病有强烈抑制效果的菌种并探究其抗香蕉枯萎病菌的作用机制。主要研究结果如下: 1.从海南不同的盐碱地中分离得到的153个菌种中,对它们进行拮抗香蕉枯萎病的活性检测,筛选出四个对香蕉枯萎病菌有较好的拮抗作用的菌株,其中有LX1菌株对香蕉枯萎病菌的抑制作用最佳。 2.对LX1菌株进行常规生理生化鉴定、16S rRNA序列同源比较以及与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌部分特异性基因序列分析。最终将LX1菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。 3.对LX1菌株的最佳生长条件确定,LX1菌株的最适生长温度为37℃、最适盐浓度为1%、最适PH为6.5。对LX1菌株的发酵上清液进行不同培养时间、温度和不同PH值处理,测定处理后的发酵上清液的抑菌活性,结果发现:在100℃时抑菌活性大大减少,这表明LX1菌株发酵上清液的活性物质可能为抑菌蛋白;PH为7时抑菌活性最大;培养时间为24h时的发酵上清液的抑菌效果最佳。 4.蛋白粗提物对香蕉枯萎病菌有较强的抑制作用,而且与未经蛋白酶K处理的蛋白粗提物的抑菌效果相比,其抑菌圈明显的变小,由此说明,LX1菌株的蛋白粗提物中的抑菌物质对蛋白酶K敏感,进一步证明了LX1菌株的发酵上清液中的主要抑菌物质含有抑菌蛋白。 5.用Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化LX1菌株的抑菌最佳的蛋白,用SDS-PAGE凝胶电泳检测到该蛋白基本得到纯化。把纯化的蛋白送到ProtTech公司测序。结果表明,该抑菌蛋白与Bacillus amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高。 6.对该抑菌蛋白的基因进行克隆及序列测定,发现该蛋白基因的编码区有1041bp,编码346个氨基酸。将测序结果于NCBI中BLAST比对分析,结果表明抗菌蛋白核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸序列同源性达99%(有七个碱基差异)。抗菌蛋白氨基酸序列与Bacillus amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶氨基酸序列同源性达100%。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S436.68

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【参考文献】
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