Cry1Aa-CpTI融合蛋白的原核表达及其对斜纹夜蛾杀虫活性研究

【摘要】：斜纹夜蛾是一种暴食性害虫,严重影响农林生产,用大量化学杀虫剂对其防治产生环境污染,严重危害人畜健康,并易使斜纹夜蛾产生抗药性；生物杀虫剂成本高,杀虫速度慢,稳定性差。研究一种杀虫速度较快,稳定性较好,成本较低的生物杀虫剂,采用先用生物杀虫剂防治,再用化学杀虫剂补防的创新防治策略,充分发挥生物杀虫剂和化学杀虫剂的各自优势,客观实际地减少化学杀虫剂的用量,可能是斜纹夜蛾等害虫综合防治的较好策略。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, BT)是目前应用最为广泛的微生物杀虫剂。BT编码杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)的基因称为cry基因,其中cry1Aa基因编码对鳞翅目昆虫有杀虫活性的蛋白Cry1Aa,但该蛋白在实际应用中仍存在稳定性差,杀虫速度慢且受施用环境影响大的问题。豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)来自豇豆的可食用部分,具有抗虫谱广且昆虫不易对其产生耐受性的特点,已被作为抗虫植物基因工程一个重要的候选基因,转到烟草、水稻、棉花和番茄等多种作物中。CpTI在分类上属于Bowmun-Birk家族,大量医学研究表明,该家族蛋白质对于对人畜不存在任何危害。基于crylAa和cpti基因的优点,将两个基因进行融合,采用体外重组DNA技术,在大肠杆菌中大量表达Cry1Aa-CpTI融合蛋白,研究其对斜纹夜蛾的杀虫活性。 首先以本实室保存含cry1Aa-cpti基因的PBI121质粒DNA为模板,PCR扩增cry1Aa-cpti基因,将cry1Aa-cpti基因连入pMD18-TSimeple克隆载体,测序结果表明连入的基因片段序列正确。其次将pMD18T-cry1Aa-cpti,经Nde I和Sal I双酶切,所获得的cry1Aa-cpti基因片段与具有NdeⅠ/SalⅠ末端的pET-30a相连接,构建表达载体pET-30a-cry1Aa-cpti。测序正确后,将表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3),构建BL21(DE3)/pET-30a-cry1Aa-cpti工程菌。然后用IPTG诱导工程菌表达Cry1Aa-CpTI包涵体融合蛋白,经细胞超声波破碎、包涵体缓冲液洗涤获得纯化的融合蛋白。十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在大约80.73 kD处有表达产物特异条带。通过对诱导温度(27、29、31、32、35、37、39-C)、诱导时间(1、2、3、4、5、6h)和IPTG诱导浓度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L)等诱导条件的优化,以确定最佳诱导表达条件为37℃下,1mmol/LIPTG诱导3h,此时表达外源蛋白量最高。Cry1Aa-CpTI融合蛋白稳定性分析表明,在37℃条件下,4天内未见降解现象,第5天开始降解。室内活性测定表明,Cry1Aa-CpTI融合蛋白对2龄斜纹夜蛾幼虫有拒食作用,1 mg/mLCry1Aa-CpTI融合蛋白,处理时间为24h,拒食率为83.8%；杀虫处理时间为48h,出现死虫现象,平均死亡率为20%；杀虫处理时间为72h,平均死亡率为70%。 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)和毒死蜱是斜纹夜蛾田间2种常用农药,用饲料混毒法分别测定甲维盐和毒死蜱对2龄斜纹夜蛾幼虫LC50：处理24h,甲维盐的LC50为4.1363μg/L,毒死蜱为273.4257μg/L；处理48h,甲维盐的LC50为3.2784μg/L,毒死蜱为130.4301μg/L；处理72h,甲维盐的LC50为0.7279μg/L,毒死蜱LC50为115.1665μg/L。 使用Cry1Aa-CpTI融合蛋白处理2龄斜纹夜蛾幼虫24h后,再测甲维盐和毒死蜱的室内毒性。处理24h,甲维盐的LC50为0.8257μg/L,降低了80.01%,毒死蜱为88.3617gg/L,降低了67.68%；处理48h,甲维盐的LC50为0.4083μg/L,降低了87.55%,毒死蜱为45.0294μg/L,降低了65.48%；处理72h,甲维盐的LC50为0.2242gg/L,降低了69.20%,毒死蜱为31.6220gg/L,降低了72.54%。处理24h、48h和72h,甲维盐LC50比单独使用平均降低了78.92%,毒死蜱平均降低了68.57%。 斜纹夜蛾室内毒性测定结果表明：Cry1Aa-CpTI融合蛋白对斜纹夜蛾有较强的拒食作用,如先用Cry1Aa-CpTI融合蛋白处理2龄斜纹夜蛾幼虫,甲维盐和毒死蜱杀虫剂的平均使用量分别降低了78.92%和68.57%也能达到单独使用时的效果。因此,本研究首次原核表达Cry1Aa-CpTI融合蛋白具有开发为防治斜纹夜蛾新型生物杀虫剂的基础,所开发的制剂可与化学杀虫剂协同使用,采用先施用生物杀虫剂,再施用化学杀虫剂补防斜纹夜蛾害虫的策略,可大幅度减少化学杀虫剂的使用量,同时降低其产生抗药性,达到环保和防治双重效果。