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《海南大学》 2011年
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木薯SBEⅡ和MeEFⅠ基因物理定位的研究

冯耀文  
【摘要】:木薯(Manihot esculenta Crantz)是世界三大薯类作物之一,同时也是重要的热带能源植物。围绕着木薯高产优质、抗逆性等相关性状,前人开展了一系列分子生物学研究,已从木薯中克隆了多种重要基因或cDNA。例如,颗粒结合型淀粉合成酶基困(gbss)、淀粉分支酶基因(she)、α-羟腈酶基因(hnl)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(G3Pdh)、苯丙氨酸解氨酶基因(PAL2)、延长因子基因(MeEF1)、富含羟脯氨酸糖蛋白基因(HRGP)、铜锌超氧化物歧化酶基因(sod)等。然而,这些基因在木薯染色体上的位置和分布特点等至今尚未见报道。本研究通过原位PCR技术对木薯淀粉分支酶相关基因(SBEⅡ)和木薯延长因子(MeEFⅠ)进行了基因定位,结果如下 设计、合成及筛选了2对特异扩增木薯淀粉分支酶基因(SBEⅡ)和木薯延长因子(MeEFⅠ)的引物。 在原先甘庶、橡胶树原位PCR技术体系的基础上,确立了适合于木薯的原位PCR技术体系。该原位PCR反应液体积为50μl,各反应组分的终浓度为:1×Buffer, 4.5 mM MCl2,0.5 mg/ml BSA,200μM的dATP、dGTP、dGTP,72μm dTTP,4μm DIG-Ⅱ-dUTP,5 U/5μ1的Taq DNA聚合酶,2μM的引物。扩增程序为:PCR扩增,先95℃变性10min,然后94℃变性1min,55℃退火1 min(视引物的Tm值),72℃延仲1.5 min,共20个循环,最后72℃延伸10min。操作流程为:5 ug/ml胃蛋白酶5 min→0.5×TBS 10min→灭菌水2×5 min→70%甲酰胺70℃变性2min→0.1×SSC冰浴1min→灭菌水冰浴1min→乙醇脱水→PCR扩增。扩增后处理流程为:0.1×PBS 37℃4-5 min→5% BSA 37℃孵育20 min→20μg/ml Anti-DIG-Fluorescein37℃孵育1 h→0.1×SSC/吐温20漂洗2×4 min→1μg/μl PI37℃孵育15 min→0.1×SSC/吐温20漂洗2×1 min→抗褪色剂Vectashield封片检测。 用SBEⅡ特异引物在华南6号的根尖(2n=36)中期细胞的染色体标本进行原位PCR扩增,在不同分裂时期的细胞核中均能发现1-2个信号位点,初步将木薯特异DNA序列SBEⅡ丛因定位于木薯华南6号的第7号染色体的长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离是63.80。 用MeEFⅠ特异引物在华南6号的根尖(2n=36)中期细胞的染色体标本进行原位PCR扩增,在不同分裂时期的细胞核中均能发现1-2个信号位点,将木薯特异DNA序列MeEFⅠ基因定位于木薯华南6号的第10号染色体的短臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离是35.11。, 对木薯华南6号进行了核型分析,华南6号的染色体数目为2n=36,染色体相对长度为3.66%-7.35%,笫2、7、18为近中着丝粒染色体(sm),其余的为中着丝粒染色体(m)。最长与最短染色体的长度比为2,平均臂比为1.44,第2、9号染色体为随体染色体。核型公式为2n=36=30m(1 sat)+6sm(1 sat)。按照Sttebbins的方法,核型分类属于2B型。
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