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三个巴西橡胶树NAC类转录因子基因的克隆和表达分析

邱琼  
【摘要】:NAC (NAM、ATAF1/2和CUC2)是近十多年发现的一类植物特有的转录因子家族,参与植物生长发育、衰老、激素调节、次生代谢和抗逆胁迫等生命活动过程。这类转录因子最大的结构特征是N端含大约150个氨基酸残基组成有高度保守的NAC结构域。天然橡胶是产胶植物的一种次生代谢产物,巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是天然橡胶的主要来源。在研究乙烯利刺激橡胶树增产分子机制的过程中,我们从构建的乙烯利调控表达的胶乳cDNA文库中获得了三个与NAC转录因子基因具有较高同源性的EST序列HbEST30、HbEST31和HbEST32。在此基础上,本研究对三个相关基因进行了克隆,对三个基因的结构以及表达特征进行了分析。主要研究结果如下: 1、根据EST序列信息,结合RACE和RT-PCR技术从巴西橡胶树胶乳中成功克隆了三个相应的基因。生物信息学分析表明,与HbEST30相应的基因cDNA全长1419bp,包含一个930bp的完整开放阅读框,编码一条含有309个氨基酸残基的多肽;与HbEST31相应的基因cDNA全长1257bp,包含一个762bp的完整开放阅读框,编码一条含有254个氨基酸残基的多肽;与HbEST32相应的基因cDNA全长1131bp,包含一个867bp的完整开放阅读框,编码一条含有289个氨基酸残基的多肽。结构分析发现,三个基因编码的蛋白都含有典型的NAC转录因子特有结构域,分别命名为HbNAC1、HbNAC2和HbNAC3。 2、蛋白结构比对发现,将HbNAC1、HbNAC2和HbNAC3三者氨基酸序列两两相互比对,HbNAC1和HbNAC2、HbNAC1和HbNAC3、HbNAC2和HbNAC3的相似性分别为17%、11%和34%,含有典型的NAC蛋白结构域HbNAC1、HbNAC2和HbNAC3的NAC蛋白结构域中的氨基酸的位置和数目各异,尤其是HbNAC1的NAC蛋白结构域与HbNAC2和HbNAC3的NAC蛋白结构域中氨基酸长度和位置差异较大;利用Genbank中序列比对发现,HbNAC1与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中相应蛋白氨基酸序列的一致性高达79%、80%、57%和60%;HbNAC2与蓖麻(Ricinus communis)毛果杨(Populus trichocarpa)、西番莲(Passiflora morifolia)、柑桔(Citrus trifoliata)和苹果(Malus x domestica)一致性分别为90%、87%、81%、77%和74%;HbNAC3与(Ricinus communis)毛果杨(Populus trichocarpa)、西番莲(Passiflora morifolia)、柑桔(Citrus trifoliata)和苹果(Malus x domestica)一致性分别为90%、87%、81%、77%和74%; 3、以叶片基因组为模板,分别克隆了三个基因的DNA序列。结果发现,HbNACl的DNA序列与cDNA序列完成一致,表明HbNACl不含有内含子;HbNAC2的DNA序列为1554bp,含有三个外显子和两个内含子HbNAC3的DNA序列为1725bp,也含有三个外显子和两个内含子。HbNAC2和HbNAC3的DNA序列结构是NAC家族典型的基因结构特征,即拥有三个外显子和两个内含子的结构。 4、构建了来自不同植物的21个NAC蛋白的系统进化树,结果发现巴西橡胶树HbNAC2/HbNAC3与ATAF距离较近,由于ATAF主要响应干旱等逆境胁迫,因此我们推测HbNAC2/HbNAC3也可能在干旱等逆境胁迫响应中发挥作用;HbNAC1与蓖麻NAC蛋白RCOM_1172140距离最近,是否参与胶乳中天然橡胶的生物合成的调控尚不可知。 5、利用染色体步移(Genome Walking)技术,从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆到了HbNACl基因514bp的5’端序列和HbNAC3基因1363bp的5’端序列。对两段序列进行分析显示,两片段除了含有典型的TATA盒、CAAT盒之外,还含有多个启动元件以及多种与非生物胁迫相关响应元件如茎尖特定激活顺式调节元件,响应茉莉酸的CGTCA-motif,光响应元件ACE,高温逆境响应元件HSE和防御逆境响应元件TC-rich repeats等,尤其是HbNAC3基因的5’端序列含有乙烯响应元件。 6、利用半定量RT-PCR技术分析了HbNACl/2/3的表达特征。结果发现,HbNACl/2/3在巴西橡胶树各组成和胶乳中都有表达,但不同组织器官中的表达量具有明显的差异性。HbNACl在胶乳中表达量最大,叶和花中次之,树皮、根中仅有少量表达;HbNAC2在花、根和树皮中的表达量较一致,但胶乳和叶片中的表达量最高;HbNAC3在树皮和胶乳中的表达量相对较低,叶、根和花中的表达量较高。检测了乙烯利刺激对胶乳中三个基因表达的影响。结果发现,乙烯利处理后3h HbNACl表达量没有明显的变化,但12h后却急剧上升,处理24h仍能维持较高的表达量;乙烯利处理后3h HbNAC2表达量却明显下降,处理24h后仍未能恢复到处理前的表达水平;与HbNAC2的表现相反,HbNAC3在乙烯利处理后3h表达量开始上升,处理24h仍能维持较高的表达量。 7、成功构建了原核表达载体pET30a-HbNAC1/2/3,经原核表达、蛋白纯化获得了相应的蛋白,为进一步筛选靶基因打下基础;成功构建了过量表达HbNAC1的植物表达载体pCAMBIA1304-HbNACl,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法获得了多株转基因阳性烟草,经过PCR检测证实,有7株烟草的基因组中含有HbNAC1基因,为深入研究HbNACl基因的生理功能奠定基础。 结论:本研究成功分离并鉴定了三个NAC转录因子的基因,分别命名为HbNAC1、 HbNAC2和HbNAC3。HbNAC1/2/3在巴西橡胶树各组织和胶乳中均有表达,而有明显的组织差异性,其中HbNACl和HbNAC2在胶乳中有大量表达,HbNAC3在花、叶和根有大量表达;ET能够调控HbNAC1/2/3在胶乳中的表达。HbNAC1/2/3是巴西橡胶树一类多功能的转录因子,在乙烯利诱导后HbNAC1和HbNAC3表达量明显增加,HbNAC2的表达量下降,这说明HbNACl/2/3可能参与了乙烯信号传导。


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