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《海南大学》 2013年
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巴西橡胶树促分裂原激活蛋白激酶基因HbMPK3和HbMPK6在先天免疫上的功能鉴定

闫志烨  
【摘要】:巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是天然橡胶的主要来源,橡胶产业在国民经济建设中发挥着不可替代的作用。橡胶树病害是影响橡胶产量的重要因素之一,研究橡胶树抗病机理具有重要意义。某些促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是植物先天免疫反应信号转导途径上的关键激酶,当其被激活时,通过磷酸化级联反应可诱导植物防卫基因的表达,进而提高植物抗病性。因此,研究橡胶树MAPK基因在橡胶树先天免疫性中的功能,对于开展橡胶树抗病基因工程及橡胶树品种改良具有理论意义和潜在的应用价值。 本论文首先从橡胶树转录组数据库中进行同源搜索蛋白激酶基因MPK3和MPK6的氨基酸序列,获得橡胶树同源基因的部分序列片段,据此设计了扩增HbMPK3和HbMPK6的特异性引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆了橡胶树与促分裂原激活蛋白激酶MPK3和MPK6同源基因的全长cDNA,并分别命名为HbMPK3和HbMPK6。核苷酸序列分析表明HbMPK3和HbMPK6基因均编码366个氨基酸,具有MAPK蛋白特有的11个Ser/Thr次级结构域,且都包含TEY三肽模体。 为了了解在植物抗病反应中与HbMPK3和HbMPK6基因相关的信号途径,我们利用RT-PCR的方法分析了不同激素信号分子处理橡胶树叶片后HbMPK3和HbMPK6基因的表达变化。实验结果显示,水样酸(SA)处理橡胶树叶片24小时后,HbMPK3和HbMPK6基因的表达没有变化,茉莉酸(JA)处理后6小时HbMPK3和HbMPK6基因的表达量受到明显诱导,暗示HbMPK3和HbMPK6基因可能参与JA信号转导途径,而与SA信号途径关系不大。 我们发现,HbMPK3和HbMPK6能够被典型的PAMPs分子细菌鞭毛蛋白flg22快速诱导表达。为了进一步验证HbMPK3和HbMPK6基因在植物先天免疫反应中的功能,我们利用模式植物拟南芥的原生质体系统和由PTI标签基因FRK1启动子驱动的(FRK1::LUC)荧光素酶报告系统分析了HbMPK3和HbMPK6对植物PTI的影响。结果表明,HbMPK3的过量表达能够增强植物的PTI反应,并且可以恢复拟南芥mpk3突变体中的减弱的PTI反应,说明橡胶树HbMPK3在植物PTI方面具有与AtMPK3相似的功能。HbMPK6的过量表达对PTI的影响不大,也不能有效恢复mpk6突变体中的PTI反应。 除此之外,我们已经把HbMPK3和HbMPK6基因转入拟南芥对应T-DNA插入突变体mpk3和mpk6中,获得了TO代种子,目前正在进行转基因植株的筛选和鉴定,这将有助于进一步分析HbMPK3、HbMPK6基因在橡胶树抗病反应中的功能。
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