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《海南大学》 2014年
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橡胶树野生种质核心库构建及抗寒核心种质与抗寒相关基因筛选

安泽伟  
【摘要】:我国的天然橡胶消费量在逐年增加,而天然橡胶的自给率却在逐年下降,到2013年天然橡胶的自给率已不足20%。我国的橡胶树种植业面临强大的增产压力,只有在努力提高天然橡胶单产的同时不断开发宜胶地,增加种植面积,才能缓解这一增产压力,而我国属于非传统植胶区,低温胁迫是限制我国天然橡胶种植业发展的主要因素,严重制约着橡胶树种植面积的增加。本研究以国家橡胶树种质资源圃保存的4462份野生橡胶树为研究对象,首先用分层聚类的方法建立橡胶树野生种质核心库,然后以我们构建的橡胶树野生种质核心库为研究对象,从核心种质中发掘野生抗寒种质;同时还对低温响应的WRKY和ERF转录因子及其启动子进行了克隆,并分析其在低温胁迫下的调控表达模式。本研究主要取得了以下研究结果: 1.对来自橡胶树原产地巴西亚马逊河流域6个地区的5个种(Hevea brasiliensis、H. nitida、H. pauciflora、H. spruceana、H. benthamiana),4462份野生种质进行了性状调查,共调查了生长速度、落叶期、抽芽期、大叶柄形状、小叶柄长度、叶片形状、叶基形状、三小叶间距、胶乳颜色、叶枕沟、叶枕膨大、蜜腺形态、腺点着生状态、腺点排列方式、腺点周边、腺点面形态、叶缘波浪等17个农艺性状和形态性状。以性状调查数据为基础,选用欧氏距离通过最短距离法进行多次聚类,结合随机取样法构建了首个橡胶树野生种质核心库。该核心种质库由279份来自6个地区的橡胶树属5个种的野生种质组成,群体遗传多样性指数为0.9300,表型频率方差为0.0652,保留了原始群体性状的全部表型。 2.通过抗寒生理指标与冻后生长恢复能力的综合分析,从核心种质中筛选到9份抗寒性强的种质:RO/JP/3/1、RO/CM/10/14、RO/CM/10/3、RO/CM/10/5、 RO/CM/10/19、RO/CM/10/37、RO/CM/10/35、MT/IT/15/13、MT/IT/15/17。 3.从热研7-33-97中克隆了5个HbWRKY转录因子基因,分别命名为HbWRKY6-1、HbWRKY6-2、HbWRKY8、HbWRKY9、HbWRKY10,其中HbWRKY6-1、 HbWRKY6-2、HbWRKY8和HbWRKY9属于WRKY.转录因子的Ⅱ-c组,HbWRKY10则为Ⅲ组。 HbWRKY6-1的cDNA长度为995bp,其中5’非编码区为225bp,3’非编码区为167bp,编码区为603bp,含有一个1010bp的内含子,编码的蛋白由200个氨基酸残基组成,分子量为22.8kDa,理论等电点为9.12;HbWRKY6-2的cDNA长度为880bp,其中5’非编码区为158bp,3’非编码区为134bp,编码区为588bp,含有一个610bp的内含子,编码的蛋白由195个氨基酸残基组成,分子量为22.6kDa,理论等电点为9.12;HbWRKY8的cDNA长度为1723bp,其中5’编码区为306bp,3’非编码区为502bp,编码区为915bp,含有两个内含子,分别为203bp和123bp,编码的蛋白质由304个氨基酸残基组成,分子量为34.1kDa,理论等电点为5.87;HbWRKY9的cDNA长度为1646bp,其中5’非编码区为196bp,3’非编码区为496bp,编码区为954bp,含有两个内含子,分别为116bp和305bp,编码的蛋白质由317个氨基酸残基组成,分子量为35.3kDa,理论等电点为6.56;HbWRKY10的cDNA长度为1480bp,其中5’非编码区为277bp,3’非编码区为174bp,编码区为1029bp,含有两个内含子,分别为105bp和205bp,编码的蛋白质由342个氨基酸残基组成,分子量为38.4kDa,理论等电点为5.56。 4.对5个HbWRKY基因的启动子序列进行了分析,结果表明,所有基因的启动子序列中都含有启动子核心区和CAAT-box,在上游的转录调控区还含有数量不等的各种顺式调控元件,如增强子区TA-rich region,增强转录水平的嘧啶富集区5'UTR Py-rich stretch, WRKY转录因子结合位点W-box, MYB转录因子结合位点MBS,分生组织特异表达调控元件CCGTCC-box,与光响应相关的调控元件G-box、ACE、BOX I、GA-motif和GT1-motif,与高温胁迫相关的HSE元件,与缺氧诱导相关的ARE、GC-motif元件,与防卫胁迫相关的A-box、AT-rich element和TC-rich repeats元件,与赤霉素、生长素、乙烯、ABA、MeJA和SA等激素响应相关的GARE-motif、AuxRR-core、TGA-element、ERE、ABRE. TGACT-motif和TCA-element等顺式调控元件。 5.从热研7-33-97中克隆了3个HbERF转录因子基因,分别命名为HbERF2-1、Hb MERF2-2、HbERF4,其中HbERF2-1和HbERF2-2属于ERF转录因子的B-2组,HbERF4则为B-3组。 HbERF2-1的cDNA长度为1718bp,其中5’非编码区为161bp,3’非编码区为399bp,编码区为1158bp,含有一个1471bp的内含子,编码的蛋白由385个氨基酸残基组成,分子量为42.6kDa,理论等电点为4.73;HbERF2-2的cDNA长度为2030bp,其中5’非编码区为435bp,3’非编码区为443bp,编码区为1152bp,含有一个1845bp的内含子,编码的蛋白由383个氨基酸残基组成,分子量为42.6kDa,理论等电点为4.82;HbERF4的cDNA长度为1345bp,其中5’非编码区为240bp,3’非编码区为286bp,编码区为819bp,无内含子,编码的蛋白由272个氨基酸残基组成,分子量为30.6kDa,理论等电点为6.6。 6.对3个HbERF基因的启动子序列进行了分析,结果表明,所有基因的启动子序列中都含有启动子核心区和CAAT-box,在上游的转录调控区还含有数量不等的顺式调控元件,如干旱诱导的MYB转录因子结合位点MBS,WRKY转录因子结合位点W-box,与防卫和胁迫相关的TC-rich repeats调控元件,与光响应相关的调控元件BOX4、ACE、GAG-motif、GT1-motif和AT1-motif,与赤霉素响应相关的GARE-motif元件,与水杨酸响应相关的调控元件TCA-element,与高温胁迫响应相关元件HSE。 7.在低温胁迫下,所检测的基因都能被诱导表达,但在不同组织和不同品种间各基因的表达模式不尽相同,在热研7-33-97和93-114的叶片与树皮中,HbERF4和HbWRKY10都能被强烈诱导,表达强度大幅上调。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S794.1

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