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《海南大学》 2014年
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香蕉枯萎病生防芽胞杆菌营养适应性及复合HE菌肥的控病作用研究

汪军  
【摘要】:由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense FOC)引起的香蕉枯萎病是世界范围内分布广、毁灭性的土传真菌病害之一,对该病的防治仍然是一个世界性难题。生物防治是近年来发展起来的前沿技术,具有安全、环保的优势,已成为研究热点。由于土壤营养相对贫瘠,通过室内平板对峙法筛选到的单一的生防菌或制剂施用到土壤后,受到土壤中生物和非生物因素的影响,难以定殖和分泌抑菌物质,导致目前生物防治成本高、田间防控不稳定。 本研究在实验室已有生防菌菌株资源的基础上,以土壤营养为出发点,通过模拟土壤环境,评价了62株不同地理来源的芽胞杆菌对营养的适应性,发现HWC-2能适应相对贫瘠的营养,对菌株HWC-2进行了鉴定与生长条件的优化;同时分离和鉴定了活性菌株室内培养产生的活性物质,对菌株进行GFP标记并比较了影响该菌株定殖和降低土壤病原菌的土壤因子,筛选获得HWC-2与实验室已有的功能不同的生防真菌淡紫拟青霉E7复配的HE菌肥配方,结合香蕉/红薯套作措施,分析了复合HE菌肥田间综合防控香蕉枯萎病的应用效果;最后通过盆栽试验研究了复合HE菌肥对香蕉枯萎病的防治机理,为高效利用拮抗生防菌开展田间综合防控提供了详实的基础数据。主要结果如下: 1.为了评价芽胞杆菌对营养的适应性。选择已报道的解淀粉芽胞杆菌C10-1和枯草芽胞杆菌BLG-01作为对照菌株,以抑菌圈为指标,比较C10-1、 BLG-O1及62株不同地理来源的芽胞杆菌在含不同营养的土壤培养基SE、 SE+CN、 SE+C、 SE+N、 SE+P、 SE+K、 SE+OF1、 SE+OF2上对FOC的抑菌圈大小,发现不同营养物质对其中4株芽胞杆菌分泌抑菌物质的促进作用由高到低为OF1CNPCOF2K;以土壤定殖力为指标,进一步比较营养(OF1和CN)与4株芽胞杆菌组合在土壤中的抑菌能力,到16d,OF1与HWC-2组合的效果最为显著,优于CN与HWC-2组合,对FOC抑制率达72.98%,对HWC-2定殖量提高了104.97%,该处理的土壤提取液平板抑菌效果也最显著,初步证实菌株HWC-2适应相对贫瘠的营养;选择菌株HWC-2进一步研究,综合运用形态学和生理生化特性、16S rDNA基因序列确定菌株HWC-2为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。优化确定菌株HWC-2适宜生长条件:碳源为白砂糖(10g/L),氮源为尿素(8g/L),无机盐浓度为Mg2+(0.6g/L), Ca2+(0.4g/L), Mn2+(0.8μmol/L), Fe2+(0.4μmol/L),培养条件为装液量200mL/500mL, pH=7,温度为35℃,170r/min,时间为48h。 2.通过PCR方法发现解淀粉芽胞杆菌HWC-2基因组中含有sfp、 ituA、 fenB和bamA基因,它们分别是Surfactin、 Iturin、 Fengycin、 Bacillomycin的生物合成相关基因。结合比较活性粗提物的耐酸碱、高温和蛋白酶特性结果推测菌株HWC-2分泌产生脂肽类物质;对影响产脂肽类物质培养条件培养基、起始pH、温度、发酵时间进行单因子优化和正交优化,确定正交2号组合(A1B2C2D2)最佳发酵条件。对脂肽类物质进行了鉴定,应用HPLC-ESI-MS检测,根据结果分析和推测分子量为:1020.5、1034.6、1042.7、1056.6、1070.6、1098.4,与以前的相关报道相比较,第一组是抗菌脂肽类物质Bacillomycin L的同系物,第二组是抗菌脂肽类物质Iturin A的同系物,第三组是抗菌脂肽类物质Bacillomycin F。 3.通过化学转化法获得GFP标记和四环素抗性的HWC-2-GFP菌株,比较了土壤质地、温度、湿度和营养及种植作物对HWC-2-GFP在土壤中对香蕉枯萎病病菌FOC作用拮抗和其定殖的影响。适宜在土壤中发挥拮抗FOC作用和定殖的土壤质地为壤土,其次为砂土和粘土;土壤温度为37℃,其次为30℃,23℃和16℃;土壤相对湿度为20%,其次为25%、15%和30%。适合的作物为红薯,其次种植玉米和种植花生;添加营养OF1促进了HWC-2-GFP发挥拮抗FOC作用和定殖,其次为P,再次为N和K。 4.模拟土壤环境,通过比较解淀粉芽胞杆菌HWC-2、与功能不同的淡紫拟青霉E7和绿色木霉H06、营养物质OF1组成的16个不同组合降低土壤中香蕉枯萎菌(FOC)数量的效果,筛选出HWC-2+E7+OF1是降低土壤FOC的最优组合,对土壤FOC数量的log cfu/g土抑制率达70%以上。因此以HWC-2+E7+OF1组合作为复合HE菌肥配方,优化了HWC-2和E7在OF1中的存活因子,发现在室温以及15℃、25℃、35℃时,控制湿度5%可延长HWC-2和E7在OF1中共存的货架期:12个月内总活菌数和单一菌株活菌数均0.2×108cfu/g。符合复合微生物肥料的活菌数标准。 5.采用完全随机区组试验,比较了辅以香蕉/红薯套作措施,施用单一菌肥与复合菌肥对香蕉生长、枯萎病病情指数、病原菌和根际土壤可培养微生物数量及土壤总呼吸速率的的影响。结果表明:与对照比较,在香蕉移栽120d时,在单作和套作条件下,施用单一H菌肥、E菌肥、复合HE菌肥均能促进香蕉的生长和提高控病作用,其中以套作与共同施用HE菌肥控病效果最显著,香蕉株高、茎围、叶宽、地上部、地下部鲜重和防效显著提高,施用H菌肥、E菌肥、复合HE处理后的病情指数下降了47.06%-72.22%,香蕉根际和不同土层的FOC数量均显著降低,根际可培养真菌、细菌和放线菌数量分别显著增加了1.10倍-6.59倍,16.08倍-39.00倍和2.63倍-3.32倍,FOC数量显著降低了97.12%-99.81%;根际土壤总呼吸速率增加了46.64%-74.53%;病情指数与FOC呈显著正相关关系,与真菌数量、细菌数量和根际土壤总呼吸速率均呈显著负相关关系。 6.通过盆栽试验对含有不同N、P、K比例的复合HE菌肥防治香蕉枯萎病的机理进行初探。结果表明:施用HE菌肥和添加营养对香蕉枯萎病有较好的控制作用,以施用HE+P处理防病效果最为显著,其次为HE+N, HE, HE+K。在香蕉移栽90d时,与对照比较,病情指数降低了50.34%-72.15%,根际FOC的log cfu/g土显著降低了27.18%-55.85%,可培养真菌、细菌和放线菌数量分别显著增加了2.28倍-49.27倍,5.89倍-241.57倍和1.87倍-4.69倍;根际土壤的总呼吸速率增加了8.20%-127.95%。在30d和60d利用HPLC-ESI-MS检测活性成分表明HWC-2在根际分泌脂肽Iturin,粗定量分析相对质量分数分别为7.55%-50.54%和4.84%-50.03%。病情指数与FOC数量呈显著正相关关系,与真菌数量、细菌数量、放线菌数量和根际土壤呼吸速率均呈显著负相关关系。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S436.68

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