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《海南大学》 2015年
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利用多重荧光定量PCR鉴定番木瓜病毒及番木瓜eIF4E家族基因干扰效应研究

霍鹏  
【摘要】:番木瓜(Carica papaya L.)为热带、南亚热带重要的特色水果之一,是一种营养价值较高的保健型水果。但是,由于番木瓜病毒病的肆虐,给番木瓜产业带来严重的经济损失。目前,在海南省发现的番木瓜病毒病主要有番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)、番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV)和番木瓜花叶病毒Papaya mosaic virus, PapMV)。三种病毒在形态学上难以区分,表现出相同症状,给番木瓜病毒的鉴定带来困扰。而现有的检测方法无法快速、精准地鉴定这三种病毒,因此,本研究建立了一种快速、灵敏检测这三种病毒的多重荧光实时定量PCR检测体系,即依靠靶标片段不同Tm值同时鉴别这三种病毒并能够精确定量。用于鉴别PRSV、PLDMV、PapMV的特异Tm值分别为81.0±0.8℃、84.7±0.6℃、88.7±0.4℃。本体系特异性强且灵敏度高,PRSV、PLDMV和PapMV的灵敏度依次为1.0×101、1.0×102、1.0×102拷贝,相对于多重反转录PCR检测方法分别灵敏100倍、10倍、10倍。同时,我们利用这一检测方法对海南省18个地区采集的共计204份番木瓜病症叶片样品进行了检测,结果显示:感染PRSV的样品有141份,占检测总量的69.12%;感染PLDMV的样品有43份,占检测总量的21.08%;感染PapMV的样品仅1份,占检测总量的0.49%;PRSV和PLDMV混和感染的样品有19份,占检测总量的9.31%。由此可见,PRSV单独感染约占70%,仍成为当前威胁番木瓜种植产业的主要病毒病害;PLDMV单独感染以及PRSV和PLDMV混和感染所造成的危害也不容勿视,应尽早做好诊断和防治。本研究建立的多重荧光定量检测方法为植物病毒鉴定研究和病害防治提供了一种可靠性高且经济实用的检测手段。 针对威胁海南省番木瓜产业的主要病毒病害PRSV以及目前番木瓜常规的抗病品种选育难度大的现状,以基因工程为技术手段培育的抗PRSV种质研究具有重要意义。目前应用的基因工程手段主要为利用病毒源基因介导的抗性,存在抗谱窄和潜在的生物安全等问题。病毒侵染植物依赖寄主因子的协助,真核翻译起始因子4E(eIF4E)是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。我们在前期研究中发现番木瓜eIF4E及其家族成员eIFiso4E均与PRSV互作。因此,本课题拟进一步研究番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因在PRSV侵染中的表达变化,并构建同时干扰两种基因的发卡RNA干扰载体,通过PEG介导法导入到番木瓜叶肉原生质体中,利用RNAi技术研究同时干扰它们表达对PRSV侵染的影响。与此同时,为保障PEG介导法的转化率,本研究还对番木瓜叶肉原生质体分离体系的酶解时间进行了优化,从原生质体产量及破损率等方面考量,以23℃酶解8小时为最优。在分离到高质量番木瓜叶肉原生质体的基础上,进一步研究了基因沉默抑制载体pGreen-Hcpro对GFP瞬时表达率的影响,通过PEG介导法将其与pRNAi-GFP共转化到番木瓜原生质体中,增强了外源GFP的瞬时表达。从而建立了一套以PEG介导的番木瓜叶肉原生质体高转化率的瞬时表达体系,为番木瓜功能基因组研究及其重要功能基因挖掘奠定了良好的基础。 借由原生质体转化体系对所构建干扰载体的沉默效应进行分析,结果表明,同时干扰两种基因(eIF4E和eIFiso4E)的载体干扰效果明显,能使eIF4E和eIFiso4E基因同时发生沉默,基因表达量分别下降了15%和48%,且PRSV的病毒量降低了49%。以上这些研究结果为探究这2个基因在PRSV侵染中的功能及作用机制,以及利用RNAi技术靶向植物基因的病毒防治新策略提供了理论和实践依据。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S436.67

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