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《海南大学》 2014年
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番木瓜及巨桉等四种植物miRNA研究和生物信息学分析

李崇奇  
【摘要】:miRNA是一类长度为19-24bp的内源性小RNA分子,其主要通过与靶基因结合后在转录后水平进行基因表达调控。近年来认为miRNA参与了植物器官发育、代谢调节和抗逆反应等一系列复杂生物学过程。本研究为了识别与番木瓜、猴面花、江南卷柏、巨桉等植物重要遗传品质相关的miRNA,应用高通量测序技术测定了番木瓜根茎叶三种组织的小RNAPRSV侵染后的番木瓜根茎叶三种组织的小RNA序列,识别了番木瓜miRNA序列;同时本研究通过分析1miRBase数据库中的所有植物miRNA序列特点,提出了植物miRNA生物信息学识别新标准;应用番木瓜、巨桉、猴面花和江南卷柏的全基因组序列进行miRNA生物信息学识别;应用EST序列对5种桉属植物、应用EST序列和GSS序列对木豆的miRNA序列进行识别,为今后进一步开展植物遗传品质改良工作奠定理论基础。主要研究结果如下: 应用高通量测序技术在番木瓜中共识别78条保守miRNA前体序列和64条保守miRNA成熟序列。从成熟miRNA的5’端分析发现:番木瓜miRNA中存在明显的碱基偏倚现象,C、U频率最高的位置分别为5’端第19碱基、第1碱基,分别为51.6%和56.3%;番木瓜miRNA上游10bp侧翼序列中嘌呤为优势碱基,同时发现上游侧翼序列中胞嘧啶出现比例明显偏低。而对miRNA下游10bp侧翼序列碱基分析发现嘧啶为优势碱基。番木瓜miRNA*序列的5’端分析发现A在第19碱基中出现频率高达55.1%;从miRNA*序列的3’端分析发现第3碱基中A出现频率高达56.4%。在64条番木瓜成熟]miRNA中共发现38个miRNA为高信度miRNA。只在番木瓜叶中表达的miRNA有4个:cpa-miR169c、cpa-miR169d、 cpa-miR408和cpa-miR482而cpa-miR164g和cpa-miR171h只在根中表达,但其表达量相对较低。没有发现只在番木瓜茎中特异表达的miRNA。病毒侵染后,新诱导出10个miRNA,分别为cpa-miR164g、cpa-miR167e、cpa-miR169c、cpa-miR169d、 cpa-miR171h、cpa-miR172d、cpa-miR319c、cpa-miR390d、cpa-miR408、cpa-miR482。靶序列中31条编码转录因子,3条编码参与蛋白质翻译的蛋白质,71条编码酶。此外有7条编码疾病抗性相关的基因,其主要受cpa-miR17、cpa-miR172c、 cpa-miR396b和cpa-miR482的调控。 在番木瓜中共识别31个特异miRNA基因,发现cpa-miR-novel-7可能通过调控RTFL5基因导致植株出现矮化现象,叶片出现斑点等症状。 通过对miRBase数据库中8496个miRNA成熟序列和6992条miRNA前体序列及高信度miRNA序列进行分析,提出在对新植物miRNA进行生物信息学预测时应满足一下标准:成熟miRNA长度应介于19-24nt,应有4种碱基组成,GC含量应介于30-70%。miRNA前体序列单碱基平均最小自由能应小于-0.2kal/mol/nt,GC含量应介于30-70%,最小自由能指数应大于等于0.7。miRNA前体序列应该通过与PFAM数据库中的蛋白质序列进行比对去除蛋白质序列,而不应该单纯依赖MFEI指数来区分蛋白质序列与miRNA前体序列。进一步分析发现当前miRBase数据库中78.9%的植物miRNA成熟序列和91.1%的高信度miRNA的前体序列参数和成熟序列参数符合该标准。而符合常用旧识别标准的miRNA仅为66.9%;高信度miRNA分子仅为76.4%。此外,番木瓜中实验证实的保守miRNA前体序列中,93.6%符合本研究提出的标准,78.2%符合旧常用标准。因而本研究提出的miRNA识别标准明显优于旧标准 应用生物信息学方法在番木瓜全基因组中新识别594个miRNA,分别属于99个不同的miRNA家族。在江南卷柏全基因组中新识别258个miRNA,分别属于78个不同的miRNA家族。在猴面花全基因组中新识别594个miRNA,分别属于85个不同的]miRNA家族。在巨桉全基因组中新识别1262个miRNA,分别属于195个不同的miRNA家族。从成熟miRNA的5’端分析,在4种植物中都发现miRNA存在明显的碱基偏倚现象,C、U频率最高的位置分别为5’端第19碱基、第1碱基。而对miRNA侧翼序列进行分析发现番木瓜、猴面花和巨桉等3种双子叶植物的侧翼序列碱基偏倚明显,上游侧翼序列所有位点中胞嘧啶出现频率都明显偏低,而对miRNA下游10bp侧翼序列鸟嘌呤出现频率明显偏低。 应用miRtour在线分析工具对5种桉属植物的EST序列和木豆EST序列及GSS序列进行miRNA生物信息学预测。在桉属植物中共预测到26条miRNA前体序列和19条不同的成熟miRNA序列。同时发现桉树]miRNA序列在碱基偏倚现象,5’端第1碱基尿嘧啶出现的频率高达52.6%,而在第19碱基胞嘧啶出现频率为61.1%。靶基因预测发现3个与木质形成相关的miRNA。而在木豆中发现43条不同的miRNA成熟序列,隶属于33个不同的miRNA家族。靶基因预测发现有36条编码序列受miRNA调控,其中17条序列编码酶,2条编码转录因子,7条编码参与细胞信号转导的蛋白,5条编码参与蛋白质降解通路的蛋白。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:Q943.2;Q811.4

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