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《海南大学》 2015年
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巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌蛋白激酶基因(CCK1)突变体功能互补分析

曹申文  
【摘要】:巴西橡胶树是重要的热带经济作物之一,其产品天然橡胶是被誉为现代工业社会的四大工业原料之一。由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola(Bert.Curt.)Wei)引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病(CLF)是巴西橡胶树上的重要病害之一。目前国内外对巴西橡胶树棒孢霉落叶病的研究主要集中在病原菌生理学、病害发生规律和防治方法等方面,在致病相关基因功能鉴定方面少见报道,而这方面的研究对揭示其致病机理和了解多主棒孢菌与巴西橡胶树之间的互作关系具有重要的学术价值,也可以为我们寻求防治该病害的新靶标打下了良好的理论基础。 本试验前期已通过敲除目标基因的方法,获得了多主棒孢菌蛋白激酶基因CCK1突变体△CCK1,并初步鉴定了其功能。为了更为准确地确定CCK1的功能,本试验采用同源克隆策略,从多主棒孢菌中扩增了蛋白激酶基因CCK1的5’端(包含完整的CCK1开放阅读框)和3’端片段,利用In-FusionR HD Cloning KGt将作为筛选标记的bar基因反向插入5’端和3,端片段之间,成功构建4CCK1突变体的互补载体pΔCCK1-C。然后从该载体上扩增一段插有5端CCK1::bar::3端CCK1的互补片段,通过PEG介导转化△CCK1突变体的原生质体,对所获得的转化子经Basta平板筛选、PCR验证,确定获得一个△CCK1突变体回复株,命名为CBB3。表型测定结果表明:通过CCK1基因互补,ΔCCK1回复株CBB3在菌丝致死温度、对不同高渗条件的敏感性以及漆酶、纤维素酶和毒素的产生等方面基本恢复至野生型水平;在CCK1的表达水平、菌落颜色、菌丝生长、产孢能力、以及对寄主的致病力等方面有一定程度的恢复,但略弱于野生型。说明蛋白激酶CCK1在多主棒孢菌菌丝的生长、发育,漆酶、纤维素酶和毒素的分泌或活性,对高温、高渗胁迫的适应性和对寄主的毒力方面起着重要的调控作用;另夕CCK1的存在可使外源Ca2+对其菌丝生长的促进作用减弱,使外源cAMP对菌丝生长的抑制作用增强。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S763.7

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