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《海南大学》 2015年
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斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)eIF2α激酶基因PKR和HRI的克隆表达和功能初步分析

高品  
【摘要】:石斑鱼是我国南部沿海及东南亚地区重要的海水养殖鱼类。石斑鱼肉质鲜美、蛋白质含量高、脂肪含量低,富含人体代谢所必须的多种氨基酸和多种维生素,是一种经济价值和营养价值都很高的食用鱼类,随着石斑鱼养殖规模的扩大及养殖环境的恶化,石斑鱼病害频发且呈逐年上升趋势,已成为石斑鱼养殖业可持续发展最大的障碍。因此,研究石斑鱼自身的免疫相关基因及其作用机制,从而提高石斑鱼的免疫力和抗病能力,对于石斑鱼养殖产业十分重要。鱼类eIF2 α激酶PKR和HRI与鱼类的免疫系统密切相关,其中,PKR能激活细胞的抗病毒能力,调节生物体的免疫机制,本文对斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)的PKR和HHI基因进行了克隆表达,并对其功能做了初步研究。本研究利用RACE技术,从石斑鱼的脾组织中克隆获得了PK 与HRI基因全长cDNA。其中石斑鱼PKR全长为2151bp,其中ORF区为1863bp,编码621个氨基酸,蛋白的分子量大小为70157.15 D,PI为5.72。石斑鱼的HRI基因全长为2467bp,其中ORF区为1995bp,编码664个氨基酸,其蛋白分子量大小为74207.58 D,PI为6.23。在NCBI网站上进行BLAST比对发现与其他物种的PKR和HRI高度同源。通过构建原核表达载体PKR-pET-32a和HR/-pET-32a,得到了PK 与HRI的融合蛋白,并对它们进行了纯化,制备了 PKR的鼠抗血清。对HRI和PKR进行组织分布研究表明,石斑鱼的各组织中均有HRI和PKR的表达,而且石斑鱼的肠道和胃中PKR基因的表达量最高,脾脏、肠道和胃中HRI表达量最高。对PKR进行了亚细胞定位研究,确定了PK 在全细胞内均有分布但主要分布在细胞质中。在热休克压力下检测石斑鱼细胞中HRI的表达量变化情况,发现HRI在未处理的GS细胞中有一定水平的本底表达,但在热休克处理后HRI的表达量逐渐升高,并在2-3小时的时候达到最高峰,之后HRI的表达量有所回落。用灭活的病毒诱导了石斑鱼GS细胞研究了HRI与PKR在病毒刺激下的表达量变化。病毒刺激后石斑鱼脑细胞中的HRI和PXR表达量相对于对照组均有不同程度的上升,其中VNN刺激下的PKR和HRI的表达量均缓缓升高,约在12小时处达到最高,在SGIV的刺激下PKR和HRI的表达量也是缓缓升高,约在48小时出表达量最高。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示,PKR和HRI均能不同程度的激活NF-κB报告基因,相对于PXR,对于NF-κB报告基因的激活作用更强。本研究表明,石斑鱼eIF2α激酶PKR和HRI在宿主抵御病毒感染的免疫反应中发挥了重要作用,本研究不仅丰富了对石斑鱼免疫应答机制的研究,也为进一步探索石斑鱼病毒性疾病的防治提供了新的策略和理论依据。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S917.4

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