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《海南大学》 2017年
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巴西橡胶树HbMYCs转录因子的靶基因鉴定

郝慧  
【摘要】:天然橡胶主要来自于巴西橡胶树,而巴西橡胶树是海南最重要的经济作物。胶乳在橡胶树韧皮部的乳管中合成和储存,乳管的数量影响胶乳的产量。茉莉酸和乙烯是调控巴西橡胶树产排胶的主要激素。茉莉酸是调节橡胶乳管分化的关键信号因子。JAZ蛋白是茉莉酸信号途径关键抑制因子,JAZ蛋白通过与茉莉酸信号途径中MYC转录因子结合来抑制其下游基因的表达。本实验室在前期工作中克隆了 3个与HbJAZ1蛋白互作的橡胶MYC转录因子,分别命名HbMYC2,HbMYC3和HbMYC4。本文为了鉴定橡胶MYC转录因子调控的靶基因,开展了以下研究:(1)利用双分子荧光互补技术验证HbJAZ1蛋白与橡胶MYC转录因子之间的互作。构建一套双分子荧光互补载体,分别是pSPYCE-HbJAZ1和pSPYNE-HbMYC3, pSPYNE-HbJAZ1和pSPYCE-HbMYC3载体。提取质粒后共转拟南芥原生质体,通过激光共聚焦显微镜观察发现,HbJAZ1与HbMYC3发生互作,无论HbMYC3与黄色荧光蛋白的C端还是N端融合表达,都能与HbJAZ1蛋白互作而激发黄色荧光。两套双分子荧光互补表达载体的结果一致,都证明HbMYC3与HbJAZ1在细胞核发生互作。(2)通过酵母单杂技术筛选与橡胶MYC转录因子互作的顺式作用元件。首先构建JRE,GCC, ABRE, ERE, G-BOX,CACG和DRE等多个顺式作用元件的pAbAi酵母单杂载体,然后构建橡胶MYC转录因子的pGADT7载体pGADT7-HHbMYC2, pGADT7-HbMYC3 和 pGADT7-HHbMYC4。两种载体共转化Y1HGold酵母菌株,然后通过酵母单杂交筛选与橡胶MYC转录因子互作的顺式作用元件。研究发现HbMYC2,HbMYC3和HbMYC4能与G-box发生互作。(3 )利用生物信息学在橡胶全基因组搜索启动子序列含有G-box(CACGTG)顺式作用元件的橡胶产排胶相关基因,并通过PlantCARE和PLACE在线软件对启动子的顺式作用元件进行确认,最后选取其中一个已知与产排胶密切相关的水通道蛋白基因HbPIP2; 1的启动子进行验证。酵母单杂实验表明HbMYC2,HbMYC3和HbMYC4都能与HbPIP2;1的启动子发生互作。(4)在植物体内验证橡胶MYC转录因子与HbPIP2;1启动子的互作及表达调控。首先构建HbPIP2; 1启动子诱导的荧光素酶报告基因植物表达载体pSP-luc+NF-HbPIP2; - ,再构建橡胶MYC转录因子植物过表达载体pCAMBIA1300-HbMYC2、pCAMBIA1300-HbMYC3 和 pCAMBIA1300-HbMYCY。将两种载体共转化拟南芥原生质体,通过荧光素酶瞬时表达情况分析橡胶MYC转录因子与HbPIP2; 1启动子之间的互作及表达调控。结果显示HbMYC2,HbMYC3, HbMYC4能与HbPIP2; 1启动子发生互作而提高报告基因的表达。(5)定量RT-PCR分析乙烯对HbMYC2,HbMYC3,HbMYC4和HbPIP2;1基因表达的影响,以乙烯处理的Oh、3h、6h、12h和24h等不同时间段的巴西橡胶树叶片cDNA为来源,RT-PCR分析发现乙烯对巴西橡胶树HbMYC2,HbMYC3,HbMYC4表现出抑制作用,而对水通道蛋白相关的基因HbPIP2; 1表现为促进作用。这些结果说明乙烯可以影响巴西橡胶树HbMYC2,HbMYC3,HbMYC4和HbPIP2;1基因表达。本文研究结果表明,茉莉酸相关的橡胶MYC转录因子HbMYC2, HbMYC3和HbMYC4能与G-box顺式作用元件互作而调控其靶基因。橡胶产排胶相关基因HbPIP2;1是其调控的靶基因之一,本文的研究结果对揭示茉莉酸调控巴西橡胶树产排胶的分子机理具有重要理论价值。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S794.1

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