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《海南大学》 2017年
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巴西橡胶树热研7-33-97第4,12,17和18号染色体文库的构建及序列分析

马梦茹  
【摘要】:橡胶树是天然橡胶的主要来源。巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)是目前国内外产生胶乳的重要物种。对巴西橡胶树进行深入的分子细胞学研究在橡胶树的育种上具有重要意义。近年来,研究者们先后在2013、2016和2017年采用高通量测序技术完成了 RRIM600、热研7-33-97、BPM24等巴西橡胶树品种的全基因组测序,但拼接水平仅达到scaffold水平。其遗传图谱、连锁群等信息并没有与染色体进行对应,功能基因在染色体组上位置和连锁关系尚未完全确定。目前的研究结果直接应用于橡胶树育种的难度较大,本研究构建了巴西橡胶树单染色体文库,可在一定程度上解决此问题。本课题组成员在国内从2013年率先开启了巴西橡胶树单染色体文库的构建工作,其他有关此方面的研究尚未见报道。故本研究从其单染色体入手,运用单染色体显微分离、LA-PCR法扩增单条染色体技术,构建了 4条巴西橡胶树单染色体文库,旨在为橡胶树的分子辅助育种提供理论基础。研究结果如下:(1)本研究采用微细玻璃针法成功地从巴西橡胶树热研7-33-97多个中期分裂相细胞中分离出31条单染色体。挑选出其中4条,用LA-PCR法对单染色体进行两轮体外扩增,通过Dot-blot杂交证实扩增产物来自巴西橡胶树基因组;将此4条染色体LA-PCR二轮扩增产物用DIG或BIO标记成探针,经荧光原位杂交(FISH)验证结合核型分析确定出4条染色体分别来自于热研7-33-97的第4、12、17和18号染色体。并成功构建了其微克隆文库,依次获得了 2.11×105、2.75×105、2.77×105、1.32×105个克隆子,其插入片段范围分别为250~1100bp、250~1200bp、300~1400bp,300~1100 bp,平均插入片段分别约为450 bp、500 bp、500 bp、550 bp。四条染色体文库的覆盖率依次约为1.1倍、1.9倍、2.4倍、1.4倍,空载率分别为0%、0%、1%、1%。(2)在热研7-33-97的第4、12、17、18号染色体文库中分别随机取100个左右阳性克隆子进行了测序,测序后分别得到100、100、101、99条序列,去除重复序列后依次有87、83、91、87条。将这些序列进行BLAST在线同源比对,与巴西橡胶树RRIM600全基因组数据库同源性大于90%的各为13、11、20、11条;与巴西橡胶树热研7-33-97全基因组数据库同源性大于90%的各为17、15、23、13条;与橡胶树EST文库同源性大于90%的分别为18、19、19、14条。EST注释的功能多数与橡胶树抗冻性、胶乳合成、耐割性、死皮病等功能相关,也有参与氨基酸前体和LCR69前体、defensin蛋白质前体的合成。(3)对四个染色体文库中与橡胶树的全基因组数据库和EST数据库高同源的序列共27条序列进行了 Blast2GO软件分析。第4号染色体构建的文库中的8条序列共得到了 9个术语注释结果:5个有关分子途径(P),3个有关细胞组件(C),1个有关分子功能(F);第12号染色体构建的文库中的7条序列中共得到9个GO术语注释结果4个有关分子途径(P), 3个有关细胞组件(C),2个有关分子功能(F);第17号染色体构建的文库6条序列共得到了 8个GO术语注释结果,3个有关分子途径(P),4个有关细胞组件(C), 1个有关分子功能(F);第18号染色体构建的文库中2条序列获得了 2个GO术语注释结果,1个有关分子途径(P),1个有关细胞组件(C),未获得有关分子功能方面的注释。这些获得注释的序列在生物学途径中参与细胞增殖、负调控的生物过程、细胞调控的过程、生物合成、N代谢等过程;在分子功能方面,有些序列影响到了转化酶的活性;在细胞组件方面,这些序列主要是参与细胞器组成、细胞固有成分组成等。第4号、12号、17号染色体文库中L-4Chr-25、L-12Chr-59、L-17Chr-4均获得了同一个酶注释:谷氨酰胺腺苷转移酶(EC 2.7.7.49),进行KEGG代谢途径分析,未获得代谢途径。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S794.1

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【参考文献】
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