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诺丽内生真菌的分离鉴定及其次生代谢产物生物活性的研究

马文婷  
【摘要】:诺丽(Morinda citrifoli.Linn.)是茜草科巴戟天属的传统药用植物,发源于南太平洋热带诸岛,在我国海南、西沙和台湾也有少量分布。诺丽的根、皮、果实和叶都被用于药用,诺丽的果富含多种糖苷类物质、醌类化合物、环烯醚萜类、维生素等化学成分或有效营养组分,对癌症、高血压、肺结核、肝中毒、及抗氧化等疾病作用显著。虽然诺丽具有特殊的抗癌、抗氧化效果,但尚处于研究过程中,并且由于其生长条件的限制、种群分布的局限性和人们的疯狂追捧,致使该物种种质资源并不丰富,而且遭遇肆意砍伐和破坏,处于濒危灭绝边缘,故寻找新来源的抗氧化、抗肿瘤活性物质非常紧迫。海南拥有适宜诺丽生长的热带沿海气候和土壤条件,对诺丽的开发研究具有地理优势。本课题以海南省特色热带药用植物诺丽八成熟健康果和叶为材料,进行表明消毒,分离提取内生真菌,采用菌落特征和26srDNAD1/D2区域和ITSrDNA序列测序鉴定菌种。利用Mothur软件的Further Neighbor原则在0.03差异水平下对获取序列划分可操作分类单元(operation taxonomic unit,OTU),应用MEGA5.2.1软件按照N-J法构建聚类分析树状图。采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和FRAP总还原能力分析其次生代谢产物的抗氧化能力,用福林-肖卡法和AlCl3显色法测定其次生代谢产物总多酚(TPC)、总黄酮(TFC)成分含量并分析抗氧化活性。以肝癌SMMC-7721、肺癌Lewis、前列腺癌PC-3为指示癌细胞,采用MTT法对其次生代谢产物的抗肿瘤活性进行测试,得到主要结果如下:(1)本实验共设计了三个空白对照试验(环境对照、表面灭菌检测以及组织印迹法),结果表明本次诺丽果和叶表面消毒彻底并且实验所得真菌即其内生真菌。本次试验中所使用的表面消毒试剂是75%酒精和2.6%次氯酸钠并按照时间梯度进行试验,实验结果表明,180 s+30s、180 s+60s处理8天左右出菌效果最好,菌落个数为 7-10 个,菌种 4-5 种;120s+30s、120s+60s、240s+30s、240s+60s、300s+30s、300s+60处理8天左右出菌效果良好,菌落个数为4-5个,菌种2-3种;80s+180s、240s+150s、240s+180s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s处理没有菌落长出。(2)本实验共分离纯化得到内生真菌共102株,观察其菌落形态特征初步鉴定为63种。通过PCR扩增获得序列,根据序列相似性(以97%为阈值),将获得的63株内生真菌划分为36个OTU,并构建其系统发育树,进行聚类分析。结果显示63个内生真菌分别属于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)两个类群,部分属于隔孢球壳科(Didymosphaeriaceae)、煤炱菌科(Capnodiaceae)、Magnaporthaceae,其余属于枝孢属(Cldosporium)、曲霉属(Aspergillus)、刺盘孢属(Colletotrichum)、间座壳属(Diaporthe)、炭团菌属(Hypoxylon)镰刀菌属(Fusarium)、叶点霉属(Phyllosticta)、赤霉属(Gibberella)、金担子菌属(Aureobasidium)、蔷薇色酵母属(Rhodotorula)、隐球菌属(Cryptococcus)。其中优势类群为曲霉属(Aspergillus)、枝孢属(Cladosporium),分别占分离总数的 28.57%和 15.87%,其余菌属分离率均小于10%。(3)本试验中的所有诺丽内生真菌次生代谢产物均具有不同程度的抗氧化活性,且在一定范围内呈明显的量效关系。(Hh-1、Hs-2、Hd-3)提取物的DPPH抗氧化活性范围从23.93到31.27 mmol TE/gDW,其中Hd-3次生代谢物的抗氧化活性最强;ABTS抗氧化能力基于平均TE值排序为..Hh-1(11.04 mmol TE/g DW)Hd-3(9.64 mmol TE/g DW)Hs-2(6.08 mmol TE/g DW);FRAP 铁还原抗氧化能力 Hh-1最强为 8.22 mmol TE/g DW,而 Hs-2 的能力最低能为 5.68 mmol TE/g DW;TPC 含量在(52.29-72.81)的范围之间,最高值在Hh-1提取物中发现(72.81);TFC含量在(74.34-107.95)之间,最高值在Hd-3提取物中发现(107.95)。(4)内生真菌 Hh-1,Hs-2 和 Hd-3 对 SMMC-7721(肝脏),Lewis(肺)和 PC-3(前列腺)肿瘤细胞的增殖均有不同程度的抑制作用,呈现显著的剂量依赖性和极显著的差异性(P0.05)。IC50范围从45.46到108.99μg/mL,其中的Hd-3对SMMC-7721、Lewis和PC-3肿瘤细胞的IC 50分别为45.46 μg/mL,分别为53.33μg/mL和80.48 μg/mL,具有光谱的抗肿瘤活性;Hh-1对SMMC-7721、Lewis和PC-3肿瘤细胞的IC50分别为106.18μg/mL,46.08 μg/mL和79.71μg/mL,对部分类型肿瘤细胞的抑制效果显著。其中真菌Leptoxyphium(Hd-3),可能产生氯过氧化物酶并对多种有机底物表现出泛催化活性。综上所述,海南特有传统药用植物诺丽内生真菌种类丰富,其次生代谢产物具有较强的抗氧化和抗肿瘤活性,内生真菌与宿主植物长期共生,协同进化可能导致其与宿主植物之间基因和信息的交换,从而产生类似的代谢途径和相同或相似生物活性的次生代谢产物,由此推断诺丽的生物活性可能与其内生真菌相关,为诺丽的开发利用提供一定的理论依据。


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