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《海南大学》 2018年
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木薯CIPK蛋白响应非生物胁迫的功能研究

莫春演  
【摘要】:木薯是世界上三大薯类之一,广泛种植于热带和亚热带地区,而在我国主要分布于华南地区。木薯是一种能耐受多种非生物胁迫的能源作物,具有很高的经济效益,因此探究木薯抗逆机制具有极其重要的研究意义。CBL是植物体内能识别钙信号的一类钙结合蛋白,CIPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,CBL-CIPK信号途径在植物的生长发育和响应非生物胁迫中发挥着关键作用。本研究我们从木薯中克隆CIPK家族基因,对其响应非生物胁迫的模式进行了分析,并对木薯CBL-CIPK信号途径进行研究,主要研究结果如下:1.从木薯的基因组数据库中鉴定出26个MeCIPK基因,并对MeCIPK家族基因进行命名,用聚合酶链式反应(PCR)的方法克隆扩增得到了 MeCIPK家族基因。利用生物信息学技术分析木薯MeCIPK家族蛋白的系统进化树以及分析CIPK家族基因的结构和启动子的顺式作用元件。发现MeCIPK蛋白C端调控域含有保守性的NAF/FISL和PPI结构域,MeCIPK8蛋白与AtCIPK8蛋白、MeCIPK21蛋白与AtCIPK21蛋白,MeCIPK24蛋白与AtCIPK24蛋白相似度较高,推测它们可能具有相似的功能。MeCIPK家族基因的启动子区域含有潜在响应各种非生物胁迫的顺式作用元件:响应高温胁迫的顺式作用元件(HSE)、响应低温胁迫的顺式作用元件(LTR)、响应干旱胁迫的顺式作用元件(MBS)、胁迫应答元件(TC-rich repeats)。2.通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析表明,在木薯整个生命周期中,MeCIPK家族基因在不同组织器官中表达的水平不同。MeCIPK5,6,9,10在木薯的整个生长阶段和所有组织器官中的一直处于很高的表达水平,而MeCIPK16,19,20与此相反,MeCIPK16,20主要在花中表达。通过实时荧光定量PCR对MeCIPKs家族基因在200 mM NaCl、20%PEG6000、高温、低温胁迫下的表达水平进行分析,发现MeCIPK家族基因能在某一胁迫处理时表达水平上调。在200 mM NaCl处理3 h时的根中的MeCIPK4,5,11,16,20,22,24表达水平上调明显,而3 h叶中的只有MeCIPK14,20表达水平上调。20%PEG6000 处理 9 h 根中 MeCIPK11,17,19,25 表达水平上调明显,而9h叶中只有MeCIPK11表达水平上调。低温根中MeCIPK7受低温诱导表达水平显著升高,根中MeCIPK10,13和叶中MeCIPK12,16的表达水平均受到低温诱导上调。3 h、9 h根中MeCIPK19和叶中MeCIPK2,4,17,25都受到高温的影响表达水平上调。因此可以推测该家族基因响应外界的非生物胁迫,说明木薯CIPK家族基因可能在响应非生物胁迫中起到一定的作用。3.将木薯MeCIPK蛋白与绿色荧光蛋白GFP融合表达,共聚焦显微镜分析转入拟南芥原生质体融合蛋白的定位情况,发现12个MeCIPK蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核都有分布,但主要定位在细胞质中。4.构建MeCIPKs基因的酵母双杂交表达载体,运用酵母双杂交技术研究MeCIPK蛋白与木薯MeCBL蛋白的互作关系,一共发现83对互作蛋白。其中MeCIPK24蛋白可与MeCBL2,6,10蛋白互作,MeCIPK24蛋白与拟南芥AtCIPK24蛋白同源性很高,为此可以推断MeCIPK24-MeCBL2,MeCIPK24-MeCBL6和MeCIPK24-MeCBL10互作蛋白复合体可能参与木薯响应盐胁迫的过程中并起到一定的作用。结合MeCIPK与MeCBL蛋白互作结果和MeCIPK家族基因响应非生物胁迫的表达分析,我们初步揭示木薯响应非生物胁迫的CBL-CIPK信号网络,以期为研究木薯的抗逆性提供指导,为木薯的遗传改良工作开辟新的途径。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2;S533

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