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《海南大学》 2018年
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棉花炭疽病菌分子检测及芽孢杆菌OE-04的生防机制研究

Hafiz Husnain Nawaz  
【摘要】:棉花(Gosypium spp.)属于锦葵科。棉花植株会受到不同病原体的感染,如真菌、细菌、病毒、线虫和其他害虫等。它引起了棉花许多疾病。此前有报道称,来自真菌的48个物种导致了世界上20种不同危害症状类型(Wikipedia2015)。炭疽病是棉花植株中最具破坏性的病害之一。棉花炭疽病是由病原真菌Colletotrichum gossypii Southw引起的病害,它被认为是棉花作物中最重要的病害,侵染植株的不同部分,最终导致棉花作物完全受损。炭疽菌(C.gossypii)是胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)复合种群的一员。然而,C.gloeosporioide复合种群具有较高的遗传相似性,这使得对C.gossypii的诊断具有挑战性。此外,不同地理区域的C.gossypii的孢子大小和形态特征也各不相同。本研究中,我们考察了中国不同棉花种植区,并分离了不同的C.gossypii菌株。进一步对分离到的不同菌种的形态、生长模式和致病性进行研究。同时,还对它们的寄主多样性进行探索。我们发现,不同的C.gossypii菌株具有不同的形态特征,如其中一些菌株的生长速率存在差异,我们也观察到不同C.gossypii菌株在孢子形态和大小上也存在差异。大多数C.gossypii菌株形成了具有均匀或不规则边缘的菌落,菌丝是白色至浅灰色,孢子通常在生长于菌落表面的中心;不同C.gossypii菌株在孢子颜色仍存在差异,但大部分孢子的颜色呈淡红色至橙红色;分生孢子大部分呈椭圆形,少数呈梭形。子囊壳坚硬,深棕色到黑色,不易破裂。它可能分散在菌落内部,也可能形成聚集成条状或成排。用显微镜观察,每一颗子囊中存在单核孢子囊和8个子囊孢子。单细胞的子囊孢子是透明的、椭圆形的,还有一点弯曲。分生孢子长度9.43-10.67μm和宽度2.7-3.2μm。在不同C.gossypii菌株的生长速度存在统计学差异。C.gossypii菌株CG01,CG09、CG12 CG14,CG22和CG26表现出快速生长(5.0-7.1 mm/d),菌株CG04,CG11,CG16,CG18,CG21,CG23,CG25 和 CG27 显示中等生长速度(3.9 到 5.9mm/d)和菌株 CG07 CGCG10,CG13,CG15 CG17,CG19 和 CG24 增长速度最慢(2.3 到 5.0 mm/d)。在致病性试验中,我们观察到不同的C.gossypii菌株的致病能力也不同。大多数C.gossypii分离菌株都能侵染棉花的抗病和易感品种叶片,并引起疾病。接种CG01、CG05、CG09、CG12、CG14、CG18的棉花叶片在接种后5天内出现病征,而与其它分离的C.gossypii菌株接种后,病情发展较慢。CG02、CG04、CG13、CG14、CG15、CG17、CG22、CG24、CG26、CG27菌株接种抗病棉花品种叶片后的发病速度,比接种易感棉花品种叶片的发病速度慢。CG04、CG17、CG22菌株接种的易感病棉花品种叶片也比抗性品种更迅速地出现病症。然而,在接种CG02、CG15、CG20或CG24的同时,抗性和易感的棉花品种都只出现了少数病症。用其它C.gossypii菌株接种的抗病和易感棉花品种叶片表现出中等的病症。在寄主范围试验中,我们分析了一些C.gossypii菌株在不同的宿主中具有引起感染的能力。在我们的实验中,C.gossypii成功地感染了芒果(Mangifera indica)、橡胶树(Ficus tica)和不同的番茄(Solanum lycopesicum)叶片。但是,番石榴叶子(Psidium guajava),马铃薯块茎(Solanum tuberosum),灯笼椒(Capsicum annum),香蕉树果实(Musa acuminatata)胡椒(Capsicum baccatum),胡萝卜(Daucus carota)能够抵抗 C.gossypii。除了芒果叶(Mangifera india)、橡胶树叶(Ficus tica)和不同的番茄叶(Solamnum ycopersicum)外,其他植物都出现症状。在这些植物中,番茄对C.gossypii菌株最敏感,而橡胶树叶片最不敏感。C.gossypii侵染寄主后在寄主植物上产生了不规则形状的炭疽病斑点。因此,在不同地区棉花种植区,C.gossypii存在不明确的特性,促使我们开发了一种分子诊断检测方法。为了克服形态学和致病性所产生的歧义,我们设计了一套以β-tubulin(TUB)基因为靶点的引物。在试验过程中,我们比较了 77个来自NCBI和我们分离的27个菌株的TUB基因序列,结果显示,所有这些分离株的TUB基因具有97%以上相似,只有单核苷酸之间的差异。因此,我们只关注单核苷酸现象。我们试图在序列中找到一种在所有C.gossypi 菌株(即来自中国不同省份的27株C.gossypi 菌株和GenBank的C.gossypii分离株)中具有100%的相似的序列区域,同时与其它Colletotrichum物种没有相似之处。单核苷酸多态性(SNP)的差异被放置在前引物SPSCG/F的5'端。用于设计引物对的SNP是开始密码子的一部分,但在其它属的成员中缺失。SPSCG/F和SPSCG/R引物能够扩增约294个bp的产物。SPSCG/F和SPSCG/R引物对只能扩增C.gossypii和混合有C.gossypii的Colletotrichum DNA,即使C.gossypii DNA浓度比其它物种低10倍。我们采用不同的Colletotrichum物种和其它一些真菌,用引物SPSCG/F和SPSCG/R进行特异性检测。结果表明,SPSCG/F和SPSCG/R引物对C.gossypii是高度特异性的,这一引物只能扩增到C.gossypii的TUB区域,而其它物种无法进行扩增。我们还检查了物种特异性引物(SPSCG/F,SPSCG/R)的敏感性。结果显示,物种特异性引物SPSCG/F和SPSCG/R是高度敏感的,它在与其它真菌基因组DNA进行10倍稀释的情况下,也能扩增出了 C.gossypii DNA。由于寄主范围广,在对C.gossypii所引起的作物病害进行防治的过程中,应当克服对多作物、农民和环境的不利影响。由于缺乏有效的不损害农民的健康和环境的杀菌剂,因此,我们对C.gossypii的生物防治进行研究。本系列实验旨在评估不同根际细菌菌株的拮抗活性。为此目的,我们分离、纯化和保存了 48种不同的根际细菌菌株,用于C.gossypii所引发的炭疽病的生物防治。在筛选过程中,我们观察到31株根际细菌菌株具有拮抗活性,其他17株菌株没有表现出对C.gosypii的拮抗作用。在31个不同的根际细菌分离菌株中,OE-4具有最高的拮抗作用;CDl、CE3,CD4,CE4B,CD6,PD2,PE3,PD3,TD1 和 OE5 为适度拮抗作用;CD2,CD3,CE2,CE1A,CE2A,CE5A,CE6A,CE8A,CE9A,CE2B,CE3B,CD2A,TE1,TE2,TE3,OD2,OE1,OE2 和 OE3 为轻度拮抗作用;而 CE3ACE4A,CE7A,CE1B,CE5B,CE6B,CD5,CD7,CD8,CD9,CD1A,CD3A,CD5A,PD1,PE1,PE2和OD1则没有拮抗作用。同时,我们还对12种最有前途的抗真菌根际细菌进行了定量筛选,并对真菌菌丝体的生长抑制率进行了统计分析。统计发现,CE1和OE-04是最有希望的抗真菌根际分离株。选择CE1和OE-04作为高度拮抗剂,选择CD1,CE3,CD4,CE4B,CD6,PD2,PE3,PD3,TD1 和 OE5 作为中度拮抗剂。发现CD6拮抗活性最低。因此,为了进一步研究,我们使用了高度拮抗的根际细菌CE1和OE-04。根据它们的细胞形态,菌落结构和生长特征鉴定了根际菌株CE1和OE-4。在生化和生长特性试验中,两株根际细菌菌株CE4和OE-4均显示阳性结果,而在55℃生长试验中,菌株CE1为阴性,因此我们使用OE-4菌株进一步研究。根据分子水平研究结果,根际菌株OE-04为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。我们使用地衣芽孢杆菌OE-04菌株分泌的生物表面活性剂抑制棉花炭疽病菌,并从48株根际细菌中筛选出该菌株。我们观察到OE-4菌株分泌物能抑制真菌菌丝体,并且这些区域在菌丝体的外围边缘。我们注意到分泌物使棉花炭疽菌培养物产生了一些形态异常。在对照处理中,真菌菌丝体未损伤,拉伸且光滑,没有任何改变。我们还探索了菌株0E-04分泌的生物表面活性剂的热稳定性和pH范围以及毒性。结果表明,生物表面活性剂对棉炭疽菌具有最大的拮抗活性。体外研究得出结论,生物表面活性剂可通过抑制棉花炭疽菌的孢子萌发而降低真菌活性。而且,生物表面活性剂也具有很广泛的pH和温度范围。我们观察到生物表面活性剂在pH5~10范围内、温度从室温至100℃范围内都有抗真菌活性。我们分析了在pH值低于5和超过10时,地衣芽孢杆菌OE-04的生物表面活性剂的抗真菌活性显著降低,并且分析了在100℃之后针对炭疽病菌的抗真菌活性显著降低。不同处理的寄主植物中H2O2的产生表明0E-04菌株产生的生物表面活性剂具有控制该病害的能力,而且也有助于提高寄主植物的免疫力。我们还观察到地衣芽孢杆菌产生的生物表面活性剂对斑马鱼(Daniorerio)的毒性。我们注意到生物表面活性剂对最大浓度的影响最小。我们观察到,地衣芽孢杆菌菌株OE-4的生物表面活性剂具有作为棉花炭疽病的生物防治剂的巨大潜力。根据数据分析,在用或不用菌株OE-04产生的生物表面活性剂处理时,观察到棉炭疽病菌的致病活性存在显著差异。T1治疗显示出最大的感染,T2显示与T1相比最低的感染。T3和T4显示没有疾病症状。为了检查对棉花炭疽菌菌株的杀菌敏感性,使用体外菌丝体生长测定法评估了咪鲜胺,phenamacril,代森锰锌,丙环唑,苯菌灵,嘧菌环胺,嘧菌酯,多菌灵和噻苯唑。我们观察到不同处理浓度对菌丝体质量和产孢量的影响较大。当我们进行重复实验时,我们也注意到,如果我们用添加了杀菌剂的培养物接种真菌时,发现第一次接种和第二次接种有显著差异。本研究是对棉花炭疽病从病原鉴定到防治的较为全面研究,对棉花炭疽病的生物防治具有重要意义。地衣芽孢杆菌OE-04的表面活性剂可以作为替代化学农药防治棉花炭疽病的重要生物防治因子。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S435.62

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