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《海南大学》 2018年
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巴西橡胶树冷胁迫诱导DNA甲基化修饰研究

唐潇  
【摘要】:巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)起源于亚马孙河流域低纬度地区的热带雨林。上世纪80年代,橡胶种植向高纬度非传统种植区扩展,寒害成为限制橡胶种植和产量的主要因素之一,橡胶种植能够向高纬度区域扩展也被认为是受益于选育出耐寒的橡胶品种。然而,巴西橡胶树的种质资源多样性不足,橡胶树的生育周期又很长,加上橡胶种子大并且种植密度较低,使橡胶树杂交育种变得十分困难。但为什么橡胶耐寒品种能够在这么短的时间内培育出来,其中到底蕴含怎样的分子机制?值得进行探索。为此,本文从表观遗传学的角度研究橡胶冷胁迫相关的分子机理,取得以下研究结果:(1)首先,为了研究低温通路中应答基因和甲基化相关基因是否受低温的诱导。对海南主栽品种热研7-33-97无性系克隆组培苗进行短期冷处理,qRT-PCR结果显示,冷胁迫关键基因HBICE1和HbCBF2,冷胁迫应答基因(COR)和DNA甲基化相关基因(如HbMET)的表达都受到冷胁迫诱导,表达水平出现不同程度改变。(2)其次,为了鉴定冷胁迫处理是否引起表观遗传学修饰的改变,对热研7-33-97无性系组培苗进行长时间冷胁迫处理,发现处理会造成组培苗明显的表型变化,如叶片变黄、叶绿素含量降低和生长受到抑制。全基因组的甲基化CpG岛扩增法扫描差异分析(MCA)显示,长时间的冷胁迫处理使橡胶全基因组CpG岛的甲基化修饰发生改变。此外,长时间冷胁迫处理不仅提高了冷胁迫关键基因(HbICE1、HbCBF2和COR基因等)和DNA甲基化相关基因HbMET的转录活性水平,而且还诱导了HbICE1、HbCBF2和HbMET基因启动子DNA去甲基化。但长时间冷胁迫只提高DNA去甲基化相关基因如HbDMEs,HbROS和和HbDMLs的转录水平,没有改变这些基因启动子的甲基化状态。而且,针对DNA去甲基化相关基因家族的短时间、多品种和组织特异性的表达分析。进一步证明了 DNA去甲基化家族基因由于低温的长时间的积累胁迫,影响了其相关基因表达机制更加明显的变化。(3)为了进一步研究在自然条件下冷胁迫关键基因和DNA甲基化相关基因启动子的甲基化状态,分别在4月份和10月份两个时间点从海南三亚市、海南文昌市、云南西双版纳和云南普洱市4个不同纬度的橡胶园取样,然后进行基因表达分析和DNA甲基化分析。研究结果显示,HbICE1和HbMET基因启动子在4月份收集的海南文昌市,云南西双版纳和云南普洱市3个不同纬度橡胶园的样品中出现了普遍的去甲基化现象,而在三亚市收集的样品未出现去甲基化现象。在10月份收集的几乎所有样品中,HbICE1和HbMET基因启动子出现高甲基化现象。这种DNA甲基化修饰与温度呈现显著相关性,但与橡胶品种没有相关性,表明环境温度可能通过DNA甲基化修饰改变冷胁迫相关基因的表观遗传学修饰,从而影响这些基因的表达和橡胶的耐寒性。(4)为了研究在自然条件下冷胁迫相关基因和DNA甲基化相关基因启动子的甲基化状态与差异表达之间可能存在的相关性,利用基因表达分析和热图展示,揭示了冷胁迫诱导的DNA去甲基化与COR基因的表达水平存在高度相关性;在12个橡胶品种的HbICE1和HbMET基因启动子序列中的SNP数目很少,说明橡胶耐寒相关基因的遗传变异很少,橡胶的耐寒性与表观遗传学关联性更高。橡胶受到的冷诱导的表观遗传修饰比通过长期耐寒性或其他生物非生物胁迫造成遗传变异更为重要。(5)为了全面筛选低温处理差异表达的基因,将长时间低温处理的样品进行数字表达谱分析(DGE),发现低温处理诱导3693个基因表达量上调,2043个基因表达量下调。差异表达基因在KEGG代谢通路分类中主要在代谢(Metabolism),环境信息处理(Environmental Information Processing),遗传信息处理(Genetic Information Processing),有机体系统(Organismal Systems),和细胞过程(Cellular Processes)等五个代谢通路中富集,在122个通路都有不同程度的表达水平的变化。(6)最后,为揭示冷胁迫诱导差异表达基因与DNA甲基化修饰之间是否存在相关性,进行了橡胶树冷胁迫处理的全基因组简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)分析。研究结果表明,长时间低温处理后橡胶基因组的CpG岛发生普遍去甲基化现象,广泛地分布在基因的编码区及功能调控区。在此基础上,进行了个性化的RNA-seq数据贯穿RRBS数据的分析。通过分析冷胁迫差异表达基因的甲基化区域(DMR)的分布,发现在基因上游2kb序列中,距离编码区越远,DNA甲基化程度越高,而低温处理后DNA去甲基化程度明显提高,发生去甲基化的CpG岛类型主要是CHG和CHH。非常有趣的是,低温处理后基因组中转座子序列的甲基化程度有所提高,甲基化水平提高的CpG岛类型主要是CG型。对贯穿得到全基因组差异基因的甲基化差异分布及数据聚类分析,发现400多个甲基化差异变化明显的基因,锌指蛋白基因、叶绿体相关基因以及胁迫相关基因,这些基因的甲基化水平和表达水平都受到低温处理的影响。综上所述,巴西橡胶树低温信号途径的相关基因、DNA甲基化以及去甲基化相关基因的表达均受低温调控,长时间的冷胁迫会诱导HbICE1、HbCBF2和HbMET基因的启动子DNA发生去甲基化。在自然条件下,不同橡胶品种的HbICE1和HbMET基因启动子的甲基化修饰出现周期变化,即冬季的温度较低地区不同橡胶品种的HbICE1和HbMET基因启动子出现去甲基化现象,而温度较高的地区和温度较高的季节则维持基因启动子甲基化水平。由于不同品种的HbICE和HbMET基因启动子序列几乎不存在差异,因此可以认为,橡胶应对冷胁迫主要通过表观遗传学修饰来调控,与橡胶的遗传背景相关性不大,表明橡胶耐寒品种很可能是低温诱导表观遗传学修饰的结果,不是杂交育种筛选的结果。该研究结果对阐明巴西橡胶树的寒害胁迫应答调控的的分子机理提供了宝贵证据,为今后橡胶耐寒育种提供了理论依据。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S794.1

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