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《海南大学》 2018年
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抗氧化活性微藻选育、扩大培养及其代谢产物研究开发

赵震宇  
【摘要】:微藻是一类在生态圈分布极广的单细胞生物。其光合利用度高并且细胞代谢产物丰富,使其在众多领域均有很好的发展前景。本文以抗氧化活性为评价指标,从众多微藻中筛选出一株最具抗氧化活性的微藻,对其种属、化学成分及规模化培养条件进行了分析和研究,主要结果如下:从100株微藻种中筛选出10株长势最为良好的微藻。通过形态学结合分子生物学(18s rDNA和ITS序列)鉴定并比对系统发育树确定种属。5株微藻分别被鉴定为胶网藻(Dictyosphaerium sp.1A10),栅藻(Desmodesmus armatus B38),Masaia oloidia 2Fg,普通小球藻(Chlorella vulgaris B43)和衣藻(Chlamydomonas chlamydogama WC11)。通过检测微藻中抗氧化酶活性及八种抗氧化实验发现:胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10中超氧歧化酶(SOD)的活性最强(935.60±12.65 U/g tissue),小球藻 Chlorella sorokiniana XS04 中过氧化氢酶(CAT)的活性最强(122.09±4.11 U/g tissue),栅藻Desmodesmus armatus B38中谷胱肽过氧化物酶(GPX)的活性最强(107.56±8.01U/gtissue);胶网藻Dictyosphaeriumsp.1A10 具有最强的 DPPH 自由基清除能力(99.60±10.00%)和氧自由基吸收能力(621.02±10.73 μmol Trolox/g),栅藻 Desmodesmus armatus B38具有最强的铁离子螯合能力(92.88±6.88%)和羟基自由基清除能力(97.10±1.76%),栅藻Scenedesmus ecomis G2具有最强的ABTS自由基清除能力(92.11±4.99%),Masaia oloidia 2Fg具有最强的铁离子还原能力(505.07±18.23μmol FeSO4/g),链带藻Desmodesmus sp.WC08具有最强的超氧阴离子清除能力(83.50±3.24%),微芒藻Micractinium reisseri C67具有最高的抗脂质过氧化能力(82.72±3.42%)。结果表明,胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10 和栅藻Desmodesmusarmatus B38的抗氧化能力最强。但是,胶网藻的7天生物量(1.97±0.23g/L)远高于栅藻的7天生物量(1.38±0.37g/L),所以,最终选定胶网藻为本研究对象。对胶网藻的化学成分进行分析,主要包括营养成分分析和天然产物分离与纯化。营养成分分析结果表明,胶网藻富含有丰富的营养成分,其中多糖含量为19.15±2.12%,油脂含量为31.45±3.21%,灰分为12.43±3.42%,蛋白质含量为14.11±5.34%,粗纤维含量为9.73±2.14%,此外其能量为471±2.56Kcal。藻粉中含有较高的亚油酸和亚麻酸,质量分数分别为油脂的15.3±5.11%和8.5±1.28%;藻粉含18种氨基酸,含量为10.16±3.12%,其中必须氨基酸占3.2±0.89%,且氨基酸的比值系数分(SRCAA)较高;藻粉中还含有7种维生素,其中VB1、VB3、VB6、VA和VE的含量较高,分别为2.15±0.08 mg/100g、6.25±0.01mg/100g、1.31±0.01 mg/100g、2.37±0.13 mg/100g 和 5.28±0.21 mg/100g;藻粉中矿物元素镁、钙、铁、钾含量较高,分别为 3517.26±8.89 mg/kg、813.27±11.13 mg/kg、301.78±8.23 mg/kg和9426.87±7.24mg/kg。此外胶网藻中的重金属元素均低于国家安全标准。因此胶网藻具有开发为新食品的潜力。对胶网藻中营养成分抗氧化性测试发现,胶网藻中蛋白质和油脂具有较强的抗氧化性,而多糖的抗氧化性较弱。对胶网藻的85%乙醇浸膏进行梯度萃取,得到石油醚段浸膏、乙酸乙酯段浸膏和正丁醇段浸膏。通过抗氧化性分析发现其中石油醚段和乙酸乙酯段浸膏的抗氧化性最强,所以对这两段浸膏进行梯度硅胶色谱分离、薄层色谱层析、凝胶色谱层析和高效液相色谱分离,分离纯化得到十个化合物和两段油脂。通过核磁共振氢谱和碳谱分析,最终鉴定十个化合物分别为(+)-3-羟基-β-紫罗兰酮、黑麦草素、黑麦草内酯,5羟基-3,4-二甲基-5-戊基-2(5H)呋喃酮,胆甾醇,3β-羟基-5α,6α-环氧-7-大柱香波龙烯-9-酮,24-氢过氧基-24-乙烯基胆甾醇,豆甾-5,24(28)-二烯-3β-D-醇、胆甾-4-烯-6β-醇-3-酮和焦脱镁叶绿酸a乙酯。实验证明十个化合物中有九种化合物具有一定抗氧化性,焦脱镁叶绿酸a乙酯不具有抗氧化性。对胶网藻的培养基、光照强度和通气量进行优化。结果表明NaHCO3、甘氨酸和360 μm/s·m2光照分别为最佳的碳源、氮源和光照密度。响应面优化结果表明:0.19 mmol/LNa2HCO3,30.00 mmol/L 甘氨酸,0.Jg/LK2HPO4,100 L/h 通气量,生物量为2.25g/L;0.94mmol/LNaHCO3,17.60mmol/L 甘氨酸,0.02g/L K2HPO4,100 L/h 通气量,油脂产率为 41.76%;0.19 mmol/L NaHCO3,14.86 mmol/L甘氨酸,0.1g/L K2HPO4,98.1 L/h通气量,油脂产量为0.74g/L。另外,将预测优化培养条件进行室外的扩大培养实验,研究了两种不同补料方式对扩大培养的影响,其中分批补料培养的生物量、油脂含量和油脂产量最高。以胶网藻抗氧化活性作为主要功能,对其抗氧化活性较强的油脂和多糖成分进行进一步分离与纯化,精制抗氧化油脂和多糖,结合多种草本天然抗氧化成分制作抗氧化精华液。精华液采用纯天然成分配比,不添加人工合成防腐剂助溶剂等刺激性成分,安全有效。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q949.9

【参考文献】
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