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《海南大学》 2017年
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巴西橡胶树乙烯信号相关基因的克隆鉴定

王启超  
【摘要】:巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)是天然橡胶的主要来源,橡胶树的产排胶过程是一个创伤反应。外施乙烯可以刺激排胶从而提高橡胶的产量。虽然乙烯在生产上大量应用,但乙烯刺激橡胶排胶的分子机理目前还知之甚少。本文将通过克隆鉴定橡胶树乙烯信号相关基因,来揭示乙烯在橡胶产排胶中的分子机理。首先利用数字表达谱,分析橡胶树乙烯应答基因。其次,采用同源克隆方法,克隆橡胶乙烯信号途径关键基因,并鉴定这些基因之间的互作,筛选其调控的下游基因,取得以下研究结果:(1)通过数字表达谱分析发现,橡胶树叶片在乙烯刺激1h后,共有2216个基因出现差异表达,其中上调基因1018个,下调基因1 198个;乙烯处理3h后的差异表达基因共有10629个,其中上调基因3697个,下调基因6932个。乙烯处理1h和3h之间差异表达基因共有9465个,其中上调基因3984个,下调基因5481个,1h和3h差异表达基因具有高度相似性。基因功能分类结果显示乙烯处理橡胶树叶片出现的差异表达基因主要涉及代谢途径(Metabolic pathways),次生代谢物生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites),和植物激素信号转导通路(Plant hormone signal transduction)。数字表达谱分析还发现,乙烯处理后橡胶胶乳样品差异表达基因相对较少,乙烯处理1h后胶乳中差异表达基因只有656个,其中上调基因56个,下调基因600个。处理3h后差异表达基因只有1047个,其中上调基因180个,下调基因867个。乙烯处理1h和3h样品之间差异表达基因有175个,其中上调基因102个,下调基因73个。(2)EIN3(ethylene insensitive 3)是乙烯信号通路关键转录因子,通过电子克隆,我们获得橡胶树HbEIN3s家族基因的4个基因,分别命名为HbEIN3,HbEIN3-1,HbEIL3-1和HbEIL3-2。生物信息学分析显示,这几个基因的蛋白结构与同其它植物的EIN3/EIL1相似,都含有一个酸性氨基酸区域,5个碱性氨基酸DNA结合结构域(BDⅠ、BDⅡ、BD Ⅲ、BD Ⅳ 和 BD Ⅴ),以及一个富含脯氨酸结构域。Western-Blot检测发现,HbEIN3蛋白存在于橡胶树胶乳的C-乳清蛋白中。亚细胞定位发现,HbEIN3定位在细胞核,并且HbEIN3自身具有转录自激活作用,说明HbEIN3具有转录因子特征。酵母单杂分析发现,这4个HbEIN3s蛋白都能与顺式作用元件DRE(dehydration responsive element)和G-box发生互作。酵母单杂研究还发现,含有DRE和G-box顺式作用元件HbEBF2和HbAOS基因的启动子可以与HbEIN3s互作,可能是HbEIN3s调控的靶基因。(3)转录因子的稳定性是通过F-box蛋白EBF(Ein3 binding factor)调控泛素化降解途径来调节的。通过同源克隆方法,我们获得2个橡胶树EBF蛋白,分别命名为HbEBF1和HbEBF2。HbEBF1和HbEBF2分别编码655个和672个氨基酸。二者都有多个LRR(leucine rich repeat)功能域。酵母双杂实验结果表明,HbEBF1和HbEBF2自身没有转录自激活活性,但可以与HbEIN3s互作,可能在转录后水平调控HbEIN3s的稳定性。(4)植物乙烯信号调控的下游有一大类转录因子是ERF转录因子(ethylene responsive factors),本文克隆其中2个橡胶ERF基因,都含有1个AP功能结构域,分别命名HbERF1和HbERF2。他们分别编码385个和258个氨基酸。酵母双杂实验表明,HbERF1和HbERF2都具有转录自激活作用。HbERF1定位在细胞核。Western-Blot检测发现HbERF1蛋白存在于橡胶树胶乳蛋白的C-乳清中。(5)生物信息学分析,橡胶基因组共有7600个基因的启动子携带8643个DRE顺式作用元件,说明有些基因的启动子携带不止一个DRE。其次,4798个基因的启动子携带ERE,还有1445个基因启动子含GCC。酵母单杂实验证明G-box与HbEIN3s转录因子强互作,因此,我们从全基因组水平筛选启动子区含G-box的功能基因。发现共有5个水通道蛋白基因(Tonoplast intrinsic protein,TIP)。此外,还有一些产胶相关基因的启动区发现携带G-box,如橡胶蔗糖转移酶(Sugar transporter,ST),橡胶延长因子(Rubber elongation factor,REF),羟甲基戊二酰辅酶A(Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase,HMGR),小橡胶粒子蛋白(Small rubber particle protein,SRPP)。表明这些基因的表达可能受到HbEIN3s转录因子的调控,从而影响橡胶的产排胶。本文的研究结果为阐明乙烯信号途径,揭示巴西橡胶树产排胶的分子机理打下良好基础。
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S794.1

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