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《海南大学》 2010年 B论文
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巴西橡胶树REF、RT和SRPP基因物理定位的研究

邱海燕  
【摘要】: 巴西橡胶(Hevea brasiliensis)是一种重要的产胶植物,其胶乳是目前工业用天然橡胶的唯一商业来源,是我国重要的战略物资,也是热带、亚热带地区的重要经济作物。前人已经对橡胶树产胶、抗逆性等相关性状开展了一系列研究,已从橡胶树中克隆了40多种重要基因或cDNA片段,但是这些基因的染色体定位却鲜见报道。基因的染色体定位对物理图谱的绘制、遗传连锁群和特定染色体的对应关系的建立、遗传图谱和物理图谱的整合具有重要的意义。本研究采用原位PCR技术对橡胶延长因子(REF)基因和利用荧光原位杂交技术(FISH)对橡胶转移酶(RT)基因和小橡胶粒子蛋白(SRPP)基因进行了物理定位的研究。主要结果如下: 对橡胶树叶片的染色体标本制作方法进行了探索,建立了适合橡胶树叶片染色体标本制备的一整套方法。 通过对前人的原位PCR技术进行改良,建立了适合巴西橡胶树基因特异DNA片段定位的原位PCR方法。改良后的原位PCR技术,具有背景低、假阳性低的特点。 首次建立了巴西橡胶树单低拷贝基因的荧光原位杂交技术体系:杂交液总体积为20μ.1,各组分的终浓度为:50%去离子甲酰胺,10 ng/μl探针,10%硫酸葡聚糖,2×SSC,250 ng/μl鲑鱼精DNA,0.5%SDS;操作流程为0.1 M HCl 2 min→胃蛋白酶处理10 min→94℃水浴1 min→70%甲酰胺70℃变性2 min→乙醇脱水→杂交液变性、冰浴→共变性→杂交→信号检测。 利用改良后的橡胶树原位PCR技术,首次对产胶相关基因REF基因进行了染色体定位。在热研7-33-97不同分裂时期的细胞中均扩增到2个信号,初步将REF基因定位于热研7-33-97中期细胞第3号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离是34.51。 构建了橡胶树的双色荧光原位杂交技术体系,并用所构建的技术将RT基因和SRPP基因同时定位到了热研7-33-97的染色体上。其中RT基因被初步定位在热研7-33-97第6号染色体的长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离是42.02;SRPP基因被初步定位在热研7-33-97第8号染色体的长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离分别是56.93。


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