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《海南大学》 2010年
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巴西橡胶树HbEBP1基因表达及其功能研究

祝建顺  
【摘要】:橡胶树是多年生热带作物,常规育种周期很长,选育一个大规模推广的良种,一般要25-30年时间,且入选率很低,仅千分之几。在橡胶生产上,非生物胁迫严重影响了橡胶的产量,特别是低温、干旱。如何利用植物分子生物学技术,从橡胶树的基因上入手,通过基因功能的鉴定,发掘能够改善橡胶树性状的相关基因,再和常规育种相结合,快速培育出既能速生又能抵御寒害、旱害的新品种,已成为育种的新目标。 本研究利用从已经构建好橡胶树的低温诱导全长cDNA文库中筛选出的HbEBP1(ErbB-3 binding protein 1)基因,对其进行了序列分析、功能预测、表达模式分析以及转化拟南芥的功能鉴定,主要结果如下: 1.获得的巴西橡胶树HbEBP1基因cDNA序列总长为1462bp,其中5’端非编码区长度为141bp,3’端非编码区长度为133bp。具有完整的阅读框,编码395个氨基酸,推导的HbEBP1蛋白分子量为43.596kD,等电点为6.45。 2.生物信息学分析表明:巴西橡胶树HbEBP1基因具有三个保守结构域:增殖相关蛋白2G4(PA2G4-like)、氨肽酶M24(APP_MetAP)、甲硫氨酸氨肽酶(MAP)结构域。不存在信号肽,不是分泌蛋白;不含明显的疏水区;没有跨膜结构,属于非跨膜蛋白;定位于细胞质与细胞核,预测具有信号传导、调节生长和胁迫应答功能。 3.成功构建了(pGEX-6P-1)-HbEBP1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了诱导表达,得到了GST-HbEBP1融合蛋白。诱导条件:O.1mMIPTG,37℃,诱导4个小时。对诱导后的GST-HbEBP1融合蛋白进行了纯化,并对Map活性进行了测定,结果表明,HbEBP1基因虽然含有Map结构域,但不具有Map活性。 4.成功构建了pXCS-HbEBP1-eGFP-HAStrep真核表达载体,转化拟南芥,对HbEBP1蛋白的亚细胞定位进行了研究,结果表明HbEBP1蛋白定位于细胞质与细胞核,与生物信息学的预测相一致。 5.分别在低温、干旱及ABA等三种胁迫环境下对巴西橡胶树中HbEBP1基因的表达模式进行研究,结果表明HbEBP1受低温、干旱及ABA胁迫诱导表达。在受到胁迫的起始,反应强烈,30分钟内表达量迅速上升,随后开始下降,最后回升到一定水平并维持。巴西橡胶树HbEBP1基因对胁迫非常敏感,能够在很短的时间内启动转录和翻译来响应胁迫。 6.将获得的HbEBP1基因转化模式植物拟南芥。Northern杂交结果表明,转基因植株中HbEBP1在组成型强启动子CaMV35S驱动下,能在正常条件下表达;Southern杂交结果表明,HbEBP1在转基因拟南芥中是单拷贝插入。对转基因植株的表型分析发现,种子发芽期比野生型提前1-2天,叶面积比野生型增大1倍左右,根系发达,侧根分芽较野生多。 7.对三个转基因株系的抗寒、抗旱能力测定结果表明,HbEBP1增强了转基因植株的抗旱性,但在抗寒方面作用不明显。
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