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拟南芥CBF3基因转化巴西橡胶树的研究

李凯  
【摘要】:本研究以巴西橡胶热研7-33-97为实验材料,以调控植物抗寒性的CBF3基因为目的基因,通过农杆菌介导法和基因枪法分别转化热研7-33-97花药愈伤组织进行巴西橡胶树的转基因研究。 通过农杆菌介导转化法,研究选择转化材料、侵染后共培养时间、共培养温度、抑菌抗生素浓度等对遗传转化的影响。结果表明:选择培养30天的花药愈伤组织,侵染3min后,在20℃共培养2d,再转至添加200mg/L Cef的培养基上,可有效的控制农杆菌污染,并且愈伤组织在侵染后可继续生长。但是由于橡胶花药愈伤组织本身的成胚率十分低,加之农杆菌的侵染以及添加Cef,对愈伤组织的损伤较大,愈伤组织很难形成正常的胚状体。 研究了基因枪法转化热研7-33-97花药愈伤组织,并通过25mg/L Hyg的筛选,最终获得3株抗性苗。经过提取其叶片DNA进行PCR检测,其中一株呈阳性。该株转化苗经过扩繁4代后得到29株苗,再次提取叶片DNA进行PCR检测,结果仍然呈阳性,初步证明CBF3基因已整合到橡胶基因组中。最后用BamHI和HindⅢ分别对其DNA进行单酶切,然后进行Southern印迹杂交,结果有明显的杂交信号,而非转化的再生植株无Southern杂交信号,说明目的基因CBF3已成功整合到橡胶树的基因组中,并可稳定遗传。


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