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巴西橡胶树HbWRKY1转录因子基因的克隆与功能鉴定

张全琪  
【摘要】:WRKY是近年来发现的一类植物特有的转录因子家族,参与植物的抗逆胁迫和衰老等生理生化过程,病原菌侵染、机械伤害和植物激素类物质刺激(如乙烯利、茉莉酸、水杨酸)等均能诱导WRKY基因的表达。巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是天然橡胶的主要来源。克隆橡胶树WRKY基因,研究其在橡胶树中潜在的生物学功能,对深入了解橡胶树抗逆以及与割胶伤害有关分子特征,具有重要的意义。 获得研究结果: 1、通过筛选已构建的乙烯利刺激条件下巴西橡胶树胶乳与未处理胶乳差异表达的cDNA消减文库,我们获得了一个与WRKY转录因子具有较高同源性的EST序列HbEST125;结合RACE和RT-PCR技术,从巴西橡胶树中首次克隆了一个编码WRKY转录因子的基因,命名为HbWRKY1 (GenBank登录号:GU372969)。 2、生物信息学分析表明,该基因全长cDNA含有1234个核苷酸,包含一个912 bp的完整开放阅读框序列(ORF),编码一个含有303个氨基酸残基的多肽。推导氨基酸序列含有一个与其它植物WRKY转录因子一致的WRKY高度保守的氨基酸序列,在其C端还有一个由两个半胱氨酸和两个组氨酸组成的锌指结构,由此可以判定HbWRKY1属于WRKY家族中的第Ⅱ类;推导氨基酸序列与蓖麻(Ricinus communis, EEF47235)、白杨(Populus tremula x Populus alba, ABK41486)和大豆(Glycine max, ABC26920)相应的WRKY同源性分别高达79%、73%和58%。 3、利用GenomeWalking技术,从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆得到HbWRKY1基因1377 bp的5’端调控序列(GenBank登录号:GU372970)。序列分析显示,该片段除了含有一个典型的核心启动子区域外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,这暗示HbWRKY1转录因子可能参与了橡胶树逆胁迫、激素响应的调控。 4、利用半定量RT-PCR技术研究了HbWRKY1的表达特征。结果显示,HbWRKY1在巴西橡胶树中呈组成型表达,但具有明显的组织差异性,其在胶乳中大量表达,花中次之,树皮、根和树叶中少量表达;ET、JA和机械伤害能够诱导HbWRKY1在胶乳中的表达;干旱、ABA和白粉病侵染明显诱导HbWRKY1在叶片中的表达。 5、成功构建了HbWRKY1过量表达的植物表达载体pCAMBIA1304-HbWRKY1,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法获得了65株转基因烟草。干旱胁迫试验证实,HbWRKY1的过量表达可以明显提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力,但机械伤害、高温胁迫等对转基因和非转基因植株的影响差异不明显。 结论:HbWRKY1在巴西橡胶树中呈组成型表达,但具有明显的组织差异性,其在胶乳中大量表达,花中次之,树皮、根和树叶中少量表达;ET、JA和机械伤害能够诱导HbWRKY1在胶乳中的表达;干旱、ABA和白粉病侵染明显诱导HbWRKY1在叶片中的表达。HbWRKY1是巴西橡胶树中一类多功能的转录调控因子。干旱胁迫试验证实,过量表达HbWRKY1可以显著提高转基因植株的干旱耐受力,HbWRKY1在提高植株耐干旱能力方面发挥作用。


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