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基于matK基因和ITS序列的海南野生兰科植物DNA条形码探讨

黄明忠  
【摘要】: 兰科植物(Orchidaceae)为不易鉴别的植物类群,特别是在非生育期,许多种类间的植株形态差别细微,难于用传统分类法区别开来。不少兰科植物容易自然杂交,中间类型多,变异较大,其分类界限不是很明确,给属间、属内种的分类和整理带来了很大的困难。DNA条形码技术利用DNA片段快速鉴别物种,是分类学中辅助物种鉴定的新技术,是目前分子生物学和分类学发展的最新方向。 本研究以158份海南野生兰植物为研究材料,运用叶绿体matK基因和核糖体ITS序列两个片段作为海南野生兰科植物DNA条形码进行区分和鉴定,主要结果如下: (1) matK基因和ITS序列达到理想的DNA条形码候补片段的要求,可用作海南野生兰科植物DNA条形码的研究。研究表明,matK基因有效长度在800bp左右,ITS序列为600bp左右,其长度符合作为DNA条形码的要求。matK基因和ITS序列均有较多的信息位点数,分别为320bp和434bp,包含足够的生物信息。在供试的有效材料中,单独使用matK基因和ITS序列的鉴别效力分别达到96.90%和81.08%。 (2)构建了基于matK基因和ITS序列的海南野生兰科植物DNA条形码的技术体系。利用引物matK4(390f/1326r)和ITS2 (AB101f/AB102r),通过对PCR反应的优化研究,结果表明通过向反应体系添加增强子可解决ITS扩增难的问题,在供试的158份材料中ITS和matK均得到100%的扩增;通过探讨,选用K2P遗传距离分析、Wilconxon秩和检验及NJ系统发育树分析,集成DNA条形码分析方法。 (3)建立一种广谱、简便和微量的兰科植物基因组DNA的提取方法——改良的CTAB法(方法4)。对所有供试的150余种(涉及4个亚科,70个属)兰科植物进行DNA提取,结果表明该法可高效除去野生兰叶片中的酚类、多糖和蛋白质等杂质,DNA大小约23kb,A260/A280在1.6-2.0之间,产量在158-508 ng/μl之间,能满足后续研究的要求。 (4)基于叶绿体matK基因和核糖体ITS序列构建的系统发育树,有效地对海南野生兰科植物进行辅助鉴定,具有较高的鉴定率。依据系统发育树结合现有的形态学资料,成功地将17个未识别种中的7个鉴定到种,10个鉴定到属。 (5)获得海南野生兰的145个matK基因序列和151个ITS序列,可用于海南野生兰科植物DNA条形码数据库的构建。其中,有102个种的matK基因序列和89个种的ITS序列在Genebank上未见登录。


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