高效海洋溶藻细菌的筛选及其溶藻活性物质的研究

【摘要】：近海海域水体富营养化及赤潮的频繁暴发已经成为非常普遍的海洋生态灾难,不但影响海洋生态系统的结构和功能,而且造成渔业、水产养殖业和旅游业的损失,甚至危及人类健康。从生态安全的角度考虑,开发微生物(包括溶藻细菌)作为潜在的控藻工具,相比物理及化学手段控藻具有更重要的理论和实践意义。细菌和藻类是水生态系统中相互依赖、相互竞争和相互抑制的两大类群,特别是溶藻细菌在海洋赤潮消亡过程中扮演着重要角色。本研究首先对来自红海海域的300余种海洋细菌粗提物进行了高通量筛选,发现了四种对赤潮藻球形棕囊藻(Phaeocystis globose)有明显杀灭作用的粗提物;从广西赤潮水样中也分离出了三株对不同赤潮藻有溶藻效果的细菌。在深圳大梅沙海域暴发的血红哈卡藻(Akashiwo sanguine)赤潮海水中我们分离到对血红哈卡藻具有溶藻效果的细菌,其中三株细菌(H82,H104和H115)溶藻效果较强,通过菌落特征以及16S r DNA核苷酸序列分析对以上溶藻细菌进行了初步鉴定;同时对溶藻细菌的溶藻活性、溶藻细菌VBNC状态转换等进行分析;并进一步对溶藻细菌H115的溶藻物质进行分离鉴定。本研究获得的主要结果如下:(1)以球形棕囊藻(P.globose)为实验藻种,利用香港科技大学海洋实验室提供的红海海域细菌粗提物,进行溶藻活性物质高通量筛选,选出编号为97,104,111以及259的几种溶藻活性较强的粗提物;(2)通过液体感染法从广西赤潮水样中分离到1株对血红哈卡藻(A.sanguine)具有溶藻效果的细菌(H108),1株对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)具有溶藻效果的细菌(H109),1株对球形棕囊藻(P.globose)具有溶藻效果的细菌(H107);从深圳大梅沙赤潮水样中分离到21株对血红哈卡藻具有溶藻效果的细菌,其中三株细菌溶藻效果较强,分别命名为H82、H104和H115;利用细菌16S r DNA基因对以上部分溶藻菌进行序列分析,比对结果表明:H108可能为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus strain ATCC 17749),H107可能为海科贝特氏菌(Cobetia marina strain NBRC 102605),H82可能是杀鱼交替假单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida strain IAM 12932),H104可能是溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus strain NBRC 15630),H115可能是巴西弧菌(Vibriobrasiliensis LMG 20546);(3)以血红哈卡藻(A.sanguine)为实验藻种,对从大梅沙水样分离的三个较强溶藻菌株(H82、H104和H115)进行溶藻实验,此三株溶藻菌均能在菌藻体积比比例为1:200,菌藻个数比约为100:1时能够在一小时(1 h)内使大部分藻细胞失去活动能力,藻细胞光合活性(Yield值)快速下降;4 h内藻细胞的死亡率达到97%以上;经0.22μm滤膜过滤或高温高压处理过的三种细菌菌液仍具有溶藻效果,表明它们均是通过分泌具有热稳定性的非蛋白类代谢物进行溶藻作用。测定溶藻过程中血红哈卡藻的丙二醛(MDA)含量以及抗氧化酶(SOD)活性,发现加入溶藻菌处理1 h后的血红哈卡藻MDA含量和SOD活性均有所上升,说明溶藻菌作用下的血红哈卡藻细胞的膜系统发生了过氧化反应,细胞受到损伤,从而影响了活性氧的代谢;(4)在寡营养以及低温胁迫条件下,H82、H104和H115在4 h内可以完全进入活的不可培养(VBNC)状态,表现为无法在平板培养基上形成菌落,但保留细胞活性,去除胁迫条件可能复苏。通过不同的温度和培养基等条件变化对VBNC状态H82,H104和H115的复苏条件进行探讨,发现升温(25℃)以及添加培养基均可使细菌在24 h内从VBNC状态复苏到活性状态。与活性状态的溶藻细菌相比,VBNC状态的溶藻细菌溶藻能力显著下降;利用GC-MIDI技术测定溶藻细菌VBNC状态变化前后的脂肪酸含量,结果显示:相比较活性状态,进入VBNC状态的细菌以及复苏后细菌的饱和脂肪酸比例有所上升,并且进入VBNC状态的时间越长其饱和脂肪酸比例越高;单不饱和脂肪酸比例有所下降,随进入VBNC状态的时间越长其单不饱和脂肪酸比例越低;(5)利用多糖沉淀萃取,脱盐以及阳离子交换树脂等手段将菌株H115分泌的胞外溶藻物质进行了分离和纯化,该溶藻物质最后能够利用阳离子交换树脂进行富集。利用H115的发酵液上清对丰年虾(Artemia salina)和斑马鱼(Danio rerio)进行了生物毒性的初步探讨,发现比杀藻浓度高出8倍的发酵液对丰年虾及斑马鱼均没有致死作用,证明该活性物质对海洋无脊椎及脊椎动物都没有很强毒性,这一结果为利用溶藻细菌大规模控制海洋赤潮提供了广阔前景。