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《广西大学》 2011年
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红麻细胞质雄性不育相关基因nad的克隆与再生体系初探

赵杨  
【摘要】:红麻是我国重要的纤维作物之一,它的纤维品质良好且用途广泛,具有重要的应用价值,因此被视为21世纪极具发展潜力的多用途作物。和其他作物一样,利用细胞质雄性不育系培育红麻杂交品种成为目前红麻育种的主要研究方向。 利用作物的细胞质雄性不育性(Cytoplasmic Male Sterility, CMS)是作物的杂种优势利用的主要途径,而CMS的机理又非常复杂,因此有关CMS的研究也成为国内外学者研究的热点和难点课题。大量的研究表明,细胞质雄性不育与线粒体DNA的变异有密切的联系。本课题组前期的工作通过SRAP分子标记技术证实线粒体nad基因片段在不育系和保持系中存在差异。为了更好的研究细胞质雄性不育与线粒体DNA之间的关系,本研究以红麻不育系P3A及相应保持系P3B为实验材料,建立了分离高质量红麻线粒体DNA的方法,重点克隆了可能与红麻细胞质雄性不育相关基因nadl、nad2和nad3;同时对基因nadl-9进行了半定量RT-PCR分析;对红麻再生体系建立进行了初步探索,主要结果如下: (1)采用红麻黄化苗为材料,结合密度梯度离心和差速离心的方法提取线粒体DNA(mtDNA),结果显示蔗糖密度梯度离心法比Percoll密度梯度离心法更适合于红麻线粒体的分离。提取的mtDNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测,并设计叶绿体和核特异性基因引物检测是否有污染存在,结果显示此方法提取的mtDNA纯度高,没有污染。 (2)根据NCBI数据库nad基因保守序列设计简并引物,利用PCR扩增在不育系和保持系中分别获得了nad1、nad2、nad3基因的保守序列,其长度为817bp、1052bp、235bp,把这些片段的基因序列与甜菜和毛竹、烟草、西瓜比对,其同源性分别达到98.2%、96.7%、97%,说明所扩增的片段为正确片段。并将同一基因序列在两系之间比较,发现只有个别碱基不同。其中nad1基因有2个碱基不同,分别为P3A中第115位由A→G、第411位由A→G,P3B在第247位缺失了一个A碱基,两系同源性达到99.6%。nad2基因在P3A中第189位缺失一个T碱基,第206位由G→A,第477位由A→G,第863位由A→G,第936位由C→T,同源性达到99.5%。而nad3基因只有一个碱基的差异,即第94位由G→A,同源性为99.6%。半定量RT-PCR分析得出,nad1、nad2、nad3、nad4、nad5基因表达量在两系之间没有明显差异。nad4L、nad6不育系的表达量相对保持系较高。nad7、nad9不育系的表达量相对保持系较低。(3)红麻再生体系建立初步研究得出,在培养条件为25±1℃,光照时间14 h/d,光照强度为21001x左右左右的条件下,以红麻胚为外植体材料,诱导愈伤较适宜的培养基配方为:处理A6:MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D,能诱导出能力强的愈伤组织,其量多、黄绿色、质地紧实,愈伤组织诱导发生频率高达100%。分化培养基以MS为基本培养基,添加0.5-2.5mg/mL的6-BA和0.1-0.5mag/mL的NAA,随着6-BA的浓度增加,NAA浓度较低的处理愈伤组织绿点较少,浓度较高时绿点增多,说明6-BA和NAA两种激素搭配可以诱导出分化的细胞,目前最适宜的分化培养基足处理B20:MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,但要诱导出不定芽其用量和配比还有待进一步试验。
【学位授予单位】:广西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S563.5

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【参考文献】
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