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苏云金芽孢杆菌分离与新型cry基因资源的挖掘

张文飞  
【摘要】:苏云金芽孢杆菌(简称:Bt)为土著的革兰氏阳性细菌,广泛分布于自然界,能够在各种不同的生境中分离得到,譬如土壤、树叶、水中、昆虫体内等。Bt菌区别其它芽孢杆菌的最大的特点是在生长后期有晶体蛋白会伴随芽孢的形成而生成,一般称为伴胞晶体。Bt菌株被认为是一种昆虫病原菌,其致病性主要或者完全取决于伴孢晶体蛋白,近年大量文献报道了各种Bt菌株对鳞翅目,鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目昆虫有杀虫活性,同时还发现一些Bt菌株对线虫、螨类和寄生虫有不同程度的活性。现今Bt被广泛应用商业化农业生产、森林害虫防治以及蚊虫控制,已经成为化学合成农药必要的补充或替代产品。尤其是来自Bt菌的杀虫晶体蛋白基因作为转基因作物关键性的基因资源,已经成功转入各种重要的农作物而为之提供抗虫能力最为引人关注。 然而,现有的Bt毒蛋白依然对许多重要的农业害虫无能无力,需要进一步筛选分离新型Bt菌株和毒蛋白来有效控制它们。此外,现有Bt毒蛋白多年被反复应用,部分昆虫已经或正在逐渐形成抗性。因此全世界各国还在继续开展一系列高密度Bt菌株筛选和毒蛋白基因鉴定克隆的项目。从2004年起,我们发起了对中国各自然保护区Bt资源收集和新型杀虫基因鉴定克隆的研究项目。迄今为止,我们从黑龙江的凉水国家自然保护区(温带),广西区的大王岭、十万大山和弄岗国家自然保护(亚热带),以及海南尖峰、吊罗山、霸王岭岭和五指山热带国家自然保护区,共收集了2,916份土壤样品。利用醋酸钠-温度筛选方法,总共分离获得5,915株芽孢杆菌和208份Bt菌株,菌株平均分离率为3.52%,至此,一个较具规模的芽孢杆菌和Bt菌株库在海南热带农业资源研究所(HITAR)建成。与此同时我们对Bt菌株分布和生境相互关系进行了分析,为了解Bt菌株分布和进一步分离筛选Bt菌株提供思路。 本研究中采取扫描电镜观察(SEM)、SDS-PAGE蛋白电泳分析、脉冲场电泳分析、以及生物活性测定等方法对Bt分离株进行鉴定和分析。为了鉴定Bt分离株所含有的新型杀虫晶体蛋白基因,我们发展了新的Polymerase Chain Reaction-fragment length polymorphism (PCR-RFLP)鉴定体系,从不同Bt菌株中鉴定克隆10个新型的cry基因,包括cry1Ac22、cry1Ac30、 cry1Ac31、cry30Ea1、cry30Ga2、cry40Da1、cry50Ba1和cry54Ba1等基因。研究结果表明我们发展的新型PCR-RFLP鉴定体系不仅可以鉴定已知cry基因,还能鉴定未知的cry基因,我们相信应用这套新型PCR-RFLP杀虫蛋白基因鉴定体系,将来会有更多的杀虫基因被鉴定克隆。接下来传统的DNA文库,PCR方法,包括Inverse PCR和single oligonucleotide nested-PCR(SON-PCR)等方法,被用来克隆鉴定的杀虫基因的全序列。两种表达体系用于克隆的cry基因的表达,分别用大肠杆菌和Bt无晶体突变株作为表达宿主。鳞翅目昆虫小菜蛾、双翅目昆虫致倦库蚊和白纹伊蚊以及鞘翅目昆虫椰心叶甲幼虫作为靶标昆虫用来测试表达蛋白和Bt菌株的杀虫活性。生物测定结果表明表达的Cry1蛋白对小菜蛾幼虫有很高的杀虫活性。 蚊虫是一种非常重要的疾病媒介昆虫,在全世界范围内广泛传播各种人和动物致病病毒和寄生虫,诸如疟疾、黄热病、登革热、丝虫病、乙型脑炎和西尼罗河病毒等。由于没有成功开发或者开发成本过于昂贵,目前有效的预防药和疫苗还未普及,因此控制这些蚊媒疾病主要靠控制蚊的数量来降低蚊媒疾病的大规模爆发。但由于化学合成杀蚊剂对环境污染和蚊虫极易对化学杀蚊剂产生抗性,人们逐渐把注意力转向了生物农药,以杀蚊Bt菌为代表的生物农药的表现令人鼓舞。尤其是苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)具有高效的杀蚊活性,而且蚊虫不容易对之产生抗性,最重要是对环境友好,被世界卫生组织(WHO)推荐来控制蚊虫的滋生而降低蚊媒疾病爆发。Bti作为化学杀蚊剂的补充多年来被广泛应用,长期反复使用Bti的毒素蛋白,大大增加了蚊对之产生抗性的风险。本研究中分离鉴定了30多株对蚊有活性的Bt菌株,其中BtS2160-1具有和Bti相当的杀蚊活性。但是BtS2160-1的大质粒的脉冲场电泳分析、伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE电泳分析、以及cry基因类型等与Bti表现出很大的差异。因此我们有理由相信BtS2160-1是一种新的杀蚊Bt菌株,可以与Bti的互为补充应用于蚊虫的控制,减少蚊虫对Bti的毒蛋白产生抗性的风险。 我们应用PCR-RFLP鉴定体系成功鉴定Bt S2160-1中含有cry30Eal, cry30Ga2,cry50Ba1和cry54Bal4个新型杀虫基因,但是另外2种主要的晶体蛋白(140kDa和30kDa)对应的杀虫基因没有鉴定出来。进一步利用质谱分析晶体蛋白,结果发现只有cry50Ba和cry54Ba基因被鉴定在BtS2160-1菌株中表达,其它2个cry30基因在原始宿主中不表达或者表达微弱。然而表达的Cry54Ba蛋白只表现出较低的杀蚊活性,在原始宿主中可能和其它的毒素蛋白有协同作用而发挥更大杀虫活性。基因组测序分析表明许多以前没有被鉴定的杀虫基因,但发现它们实际并没有杀虫活性,一般被认为是假基因。Bt S2160-1菌株中cry30Ea和cry30Ga基因初步鉴定在原始宿主不表达,类似于假基因。 总的来说,中国具有辽阔的疆域,具有独一无二的生态环境和地理特征,并且拥有丰富生物资源和良好的物种多样性,蕴藏了大量Bt菌株资源亟待我们开发利用。本研究着重Bt菌株资源收集和杀虫基因鉴定克隆,以期获得新杀虫菌株和杀虫基因应用于农业生产、森林保护和疾病媒介昆虫的控制,而这些研究对农业生产、环境保护和疾病防治将是非常必要和有意义的。


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