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《广西大学》 2013年
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鸡传染性支气管炎病毒广西分离株的致病性研究和细胞因子实时荧光RT-PCR相对定量检测方法的建立

吴志金  
【摘要】:传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起的鸡的一种高度接触性的急性传染病,给全球养禽业带来巨大损失。目前对IBV分子生物学方面的研究较多,有必要对地方分离株的致病性、组织嗜性及感染后病毒在鸡体内的动态变化进行研究。生产中广泛使用的弱毒苗和灭活苗都无法完全控制IB,安全高效的新型疫苗成为当前研究热点,细胞因子作为重要的免疫调节物,其表达量常常被用于疫苗免疫效果的评价。 课题首先建立了IBV的实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法。建立的标准曲线相关系数R2=0.993、扩增效率为101.5%、溶解曲线单一整齐,特异性好;最低检测浓度为7.27×101copies/μL,灵敏度高;重复试验的变异系数为0.69%-2.51%,重复性好。 其次,课题选择近年的4个IBV广西代表性分离株GX-YL11072(LX型)、GX-GL11079(LX型)、GX-NN1201(HN08型)和GX-NN09032(新型),通过点眼、滴鼻(105TOC-ID50/0.2ml/羽)分别对健康非免疫雏鸡各25羽攻毒,进行致病性的观察,于攻毒后1、3、7、14、21、28d分别采集气管、肺、肾脏、输卵管及盲肠扁桃体进行IBV的定量检测。结果表明,4个分离株都能引起雏鸡出现咳嗽、打喷嚏等呼吸道症状,潜伏期1-4d,发病率30%~100%,死亡率为0%~10%。其中GX-GL11079攻毒组的临床症状最为严重,解剖见肾脏肿大、输尿管尿酸盐沉积等病变,GX-NN09032攻毒组的气管观察到有黄色浓稠粘液;GX-NN1201、GX-YL11072和GX-GL11079组各器官的病毒载量大多在攻毒后3d达到峰值,GX-NN09032组在攻毒后7d各器官的病毒含量达到峰值,GX-GL11079攻毒组的病毒载量要高于其他3组;其中以气管的病毒载量最高且可持续到攻毒后21d,盲肠扁桃体携带病毒的持续时间最长,所有试验组均可持续至攻毒后28d。试验结果还显示4个毒株在鸡体内均都有广泛的组织嗜性。 其三,课题还建立了IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12四种鸡细胞因子的相对定量PCR检测方法,扩增效率为98.8%-103.3%,而且特异性好、重复性强;对H120弱毒苗免疫后的雏鸡脾脏进行检测,结果显示,免疫后7dIFN-γ、IL-12基因的表达量最高(P0.01),而IL-4、IL-10基因的表达量则在免疫后14d达到峰值(P0.01),分别为对照组的9.3倍和3.1倍,至免疫后21d4个细胞因子基因的表达量与对照组的已没有显著差异。 本课题的研究结果证明,建立的IBV qPCR检测方法具有特异、敏感的特点;4个IBV广西分离株都可导致雏鸡发病,且具有广泛组织嗜性,其中气管为主要的靶器官,GX-GL11079的致病性最强;建立的4种细胞因子qPCR检测方法可用于免疫后其在体内动态变化的检测。
【学位授予单位】:广西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S858.31

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