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《广西大学》 2015年
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广西陆川猪肺炎支原体病原分离及其P97R1区基因的克隆及序列分析

黎珂钰  
【摘要】:猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引发陆川猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS)的主要原因。本研究旨在对广西陆川猪Mhp进行病原分离鉴定及其P97 R1区基因序列分析,为进一步了解和研究广西陆川猪Mhp的病原特性、流行病学以及该病的综合防制提供理论依据。方法:(1)采集广西陆川猪疑似患有MPS的肺组织,常规Mhp病原分离培养后进行涂片染色和PCR方法鉴定,筛选阳性病料;(2)常规病理组织切片,HE染色观察组织病理学变化特征。采用免疫组织化学方法对组织中病原分布进行定位;用原位杂交技术对组织中Mhp的核酸进行检测、定位;(3)参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区片段的一对引物,提取基因组DNA,PCR扩增黏附因子P97基因R1区,对PCR产物进行测序,并将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比较。结果:(1)采用液体培养方法成功从疑似患有MPS的广西陆川猪肺组织中分离到M11p野毒株,液体培养物通过瑞氏一吉姆萨染色镜检,观察到环状、两极状等多形态的菌体;PCR检测液体培养物能扩增出目的片段;(2)Mhp阳性肺的病理组织HE染色结果显示,病变肺组织呈现典型的间质性肺炎以及融合性支气管肺炎变化,肺泡隔增厚,间质有大量炎性细胞增生和浸润,肺泡腔狭窄、缩小。细支气管管壁增厚,上皮细胞脱落,大量炎性细胞渗出,细支气管周围淋巴小结样增生。免疫组化结果显示,Mhp阳性信号主要分布在细支气管管壁柱状上皮细胞胞质和黏膜,管腔中的分泌物以及周围的炎性细胞胞浆中:原位杂交结果显示,Mhp DNA主要分布在气管和支气管黏膜表面。(3)广西陆川猪Mhp P97 R1区基因的碱基组成和推导的氨基酸序列比较结果显示,所扩增的15株广西陆川猪Mhp毒株与3株广西二元杂商品猪Mhp毒株的P97基因R1区多处碱基发生变异,通过推导氨基酸序列统计P97基因R1区氨基酸重复基序(AAKPV/E)数为9-18,平均值为12,TN重复数在1-4,发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其的毒力和黏附能力增强。结论:本研究成功从疑似患有MPS的广西陆川猪肺组织中分离到Mhp野毒株,并定位了肺组织中Mhp病原菌和核酸的分布情况:此外,15株广西陆川猪Mhp毒株与3株广西二元杂商品猪的Mhp毒株的P97基因R1区序列分析、比较结果表明,广西陆川猪MhpP97基因R1区发生变异。
【关键词】:陆川猪 肺炎支原体 免疫组化 原位杂交 P97 R1区基因
【学位授予单位】:广西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.62
【目录】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-12
  • 常用缩略词12-13
  • 第一章 文献综述13-24
  • 1.1 陆川猪养殖与疫病概况13-14
  • 1.1.1 陆川猪养殖概况13
  • 1.1.2 陆川猪呼吸道疾病研究进展13-14
  • 1.2 猪肺炎支原体研究概况14-17
  • 1.2.1 猪肺炎支原体病原学特征14
  • 1.2.2 猪肺炎支原体的培养特性14-15
  • 1.2.3 猪肺炎支原体流行病学研究15
  • 1.2.4 猪肺炎支原体的致病机理15-16
  • 1.2.5 猪肺炎支原体粘附因子的研究进展16
  • 1.2.6 粘附因子P9716-17
  • 1.2.7 粘附因子P10217
  • 1.3 免疫组织化学17-21
  • 1.3.1 免疫组织化学概述17-18
  • 1.3.2 免疫组化的发展18-19
  • 1.3.3 免疫组化的分类19
  • 1.3.4 免疫荧光组织化学技术19
  • 1.3.5 免疫酶组化技术19
  • 1.3.6 酶记抗体法19-20
  • 1.3.7 非标记抗体酶法20
  • 1.3.8 亲和免疫细胞化学技术20-21
  • 1.3.9 抗生物素—生物素免疫组织化学方法21
  • 1.4 原位杂交研究进展21-23
  • 1.4.1 原位杂交原理21-22
  • 1.4.2 地高辛标记探针原位杂交22
  • 1.4.3 荧光原位杂交22
  • 1.4.4 原位杂交的应用22-23
  • 1.5 本研究的目的和意义23-24
  • 第二章 广西陆川猪肺炎支原体病原分离和病理学研究24-45
  • 2.1 材料24-26
  • 2.1.1 病料采集和初步筛选24
  • 2.1.2 主要试剂24-25
  • 2.1.3 主要仪器设备25-26
  • 2.1.4 实验引物序列26
  • 2.1.5 探针合成26
  • 2.2 方法26-33
  • 2.2.1 Mhp分离培养26
  • 2.2.2 PCR检测26-27
  • 2.2.3 组织切片的制作27-28
  • 2.2.4 H.E染色28-29
  • 2.2.5 免疫组化染色29-31
  • 2.2.6 原位杂交检测31-33
  • 2.3 结果33-40
  • 2.3.1 Mhp病原分离及鉴定结果33-35
  • 2.3.2 病理组织切片结果35-37
  • 2.3.3 免疫组化结果37-39
  • 2.3.4 原位杂交显色结果39-40
  • 2.4 讨论40-44
  • 2.5 小结44-45
  • 第三章 广西陆川猪肺炎支原体P97R1区基因的序列分析45-56
  • 3.1 材料45-46
  • 3.1.1 病料来源45
  • 3.1.2 主要试剂45-46
  • 3.1.3 主要仪器设备46
  • 3.1.4 引物合成46
  • 3.2 方法46-48
  • 3.2.1 DNA的提取46-47
  • 3.2.2 PCR检测47
  • 3.2.3 Mhp P97 R1区基因片段的扩增47
  • 3.2.4 Mhp P97 R1区基因的克隆及重组质粒的酶切鉴定47
  • 3.2.5 Mhp P97 R1区基因的序列测定分析47-48
  • 3.3 结果48-54
  • 3.3.1 PCR检测结果48
  • 3.3.2 Mhp P97 R1区基因PCR扩增结果48-49
  • 3.3.3 Mhp P97 R1区基因的克隆及重组质粒的鉴定49-50
  • 3.3.4 Mhp P97 R1区基因测序结果50
  • 3.3.5 Mhp P97 R1区氨基酸序列测序结果50-51
  • 3.3.6 Mhp P97 R1区基因推导的氨基酸序列与代表毒株比对51-52
  • 3.3.7 Mhp P97 R1区氨基酸重复基序数统计52-54
  • 3.4 讨论54-55
  • 3.4.1 Mhp的PCR检测结果54
  • 3.4.2 Mhp P97 R1区基因序列分析54-55
  • 3.5 小结55-56
  • 全文结论56-57
  • 参考文献57-63
  • 攻读硕士期间发表的论文情况63-64
  • 致谢64

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