狭叶坡垒和山橙内生真菌的抑菌活性初步研究

【摘要】：植物内生真菌是具有农药活性开发潜力的重要微生物资源,不少内生真菌的次生代谢产物也具有良好的抑菌作用,在农药创制领域存在重要的影响。本研究以狭叶坡垒Hopea chinenisis Hand.-Mazz.和山橙Melodinus suaveolens Champ.ex Benth.两种植物为研究对象,采用组织块培养法、分子生物学研究等方法对两种植物的内生真菌进行了分离鉴定,并评价了分离得到的内生真菌的生物活性,旨在为具有潜在抑菌活性的内生真菌的开发提供基础数据。结合菌种形态学和分子生物学并通过NCBI基因库的序列相似性比对对两种植物的内生真菌进行了鉴定,从山橙根、枝、叶等部位中共分离出20株内生真菌,分属于2个门,2个亚门,5个纲,15个目,15个科,15个属；从狭叶坡垒根中共分离出13株内生真菌,分属于2个门,2个亚门,5个纲,9个目,12个科,13个属。平板对峙法测定结果表明:山橙菌株M4及狭叶坡垒菌株H21对水稻稻瘟病菌具有显著的抑菌活性,其抑制率达到50%以上；菌丝生长速率法测定结果表明:在20 mg/mL浓度下,菌株M4发酵液对禾谷镰刀菌、菌株H12发酵液对香蕉枯萎病4号小种均具有显著生物活性,其抑制率分别为40.92%和60.23%。分别用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇通过快速溶剂萃取法对菌株H12菌丝体进行提取,采用菌丝生长速率法测定所得粗提物其对香蕉枯萎病4号小种、香蕉炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、火龙果溃疡病菌的生物活性,结果表明:在1Omg/mL的浓度下,4种粗提物对香蕉枯萎病4号小种均无生物活性,而对香蕉炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、火龙果溃疡病菌均具有一定的生物活性,其中石油醚粗提物对水稻稻瘟病菌的抑制率最为显著,为18.15%,乙酸乙酯粗提物对香蕉炭疽病菌的抑制率最为显著,为32.84%,甲醇粗提物对水稻稻瘟病菌的抑制率最为显著,为76.79%,丙酮粗提物对香蕉炭疽病菌的抑制率最为显著,为43.95%。结合基因克隆与序列分析构建系统发育树,将菌株H12鉴定为Piptoporellus soloniensis。综合运用硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、薄层层析等分离技术对P.soloniensis菌丝体甲醇和丙酮粗提物进行了初步化学成分分离,得到3个化合物,化合物1鉴定为ergosta-5,7,22-trien-3ββ-o1,化合物2鉴定为(22E)-5α，8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-o1,化合物3结构待鉴定。其中化合物2对香蕉枯萎病4号小种、香蕉炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、火龙果溃疡病菌均无显著的生物活性。本研究从狭叶坡垒和山橙中分离并鉴定了 33株内生真菌,其中P.soloniensis为抑菌活性显著菌株并对此菌株发酵液及菌丝体粗提物进行了活性评估。研究结果表明,两种植物中均有开发成生物源杀菌剂的内生真菌,在农业上具有重要的开发价值。