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运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

陆坚  
【摘要】: 由于石油的日渐枯竭,燃料酒精有望成为未来替代汽油燃料的能源。木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源。对木质纤维素利用的研究,特别是通过微生物将木质纤维素转化为乙醇是当前研究热点之一,也是难点之一。 要从木质纤维素生成乙醇,所利用的微生物必须能同化所有的戊糖、已糖成分,而且含有生成乙醇的关键酶:丙酮酸脱羧酶(PDC)和乙醇脱氢酶Ⅱ(ADHⅡ)。目前,还没有发现哪一种微生物能将所有的糖有效地全部转化成酒精。大肠杆菌含有同化戊糖和己糖的所有必需酶,但缺乏PDC-ADHⅡ系统,只能生成非常少的酒精。相反,运动发酵单胞菌具有较强的PDC-ADHⅡ系统,能很好地发酵生成酒精,但只能利用葡萄糖和果糖。 本论文以Zymomonas mobilis DNA为模板,PCR扩增Zymomonas mobilis中的乙醇脱氢酶基因(adhB)和丙酮酸脱羧酶基因(pdc),分别构建表达质粒pSE-adhB和pSE-pdc并在大肠杆菌DH5α中表达。在乙醛指示平板上均能检测到它们的活性。SDS-PAGE电泳分析表明:有表达分子量为40KD(ADHⅡ)和60KD(PDC)的蛋白质。因此可用于多顺反子表达质粒构建试验 将pdc基因,含核糖体结合位点(RBS)的adhB基因和终止子串联起来置于trc启动子控制下构成多顺反子表达质粒pSE-pdc-adhB-terminator,转入大肠杆菌DH5α内,重组菌株经IPTG诱导,在含10%葡萄糖培养基中于37℃培养72小时,有乙醇产生,产酒率为0.08g乙醇/g葡萄糖;在含10%木糖培养基中于37℃培养72小时,有乙醇产生,产酒率为0.03g乙醇/g木糖,而不含多顺反子表达质粒的对照菌株则几乎没有乙醇生成。 本研究成功地将adhB和pdc基因引入大肠杆菌,在大肠杆菌中建立了一条 新的代谢葡萄糖生成乙醇的途径,同类研究在国内尚无报道。


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