广西禽白血病病毒流行株的分子鉴定和分型研究

【摘要】： 应用本实验室建立的肿瘤病快速鉴别诊断技术，对临床送检的苍白消瘦、有肿瘤病变或肝脾肿大的患鸡病料或本实验室保存的DNA样品250份进行ALV的检测。结果共鉴定出32份有外源性白血病病毒(ALV)感染的样品，阳性率达到12.8％。同时对这些样品进行MDV的检测，结果MDV阳性率高达93.75％(30／32)。 分别从外源性白血病病毒阳性的DNA样品以及普通鸡胚CEF抽提的DNA，用内、外源性禽白血病病毒共用的一对引物扩增囊膜基因(env)，目的带约长1.26kb。根据已经发表在NCBI的ALV-A、B、E亚群的序列情况，分析多态性酶切位点，运用不同的限制酶BglⅡ，BamHⅠ，SspⅠ进行分型。结果发现，扩增到的目的带只能用对A亚群特异的BglⅡ限制酶或对A、E亚群特异的SspⅠ限制酶切开，而不能用对B亚群特异的BamHⅠ限制酶切开。这表明，所扩增的片段为A亚群和E亚群的ALV。 随机将三份由不同地方的DNA样品扩增到的囊膜基因(env)克隆进PMD18-T，并转化DH5α大肠杆菌，经培养并用IPTG、X-gal筛选以后，抽提质粒DNA，经PCR以及酶切筛选带有目的片段的rDNA。将SspⅠ酶切阳性的三个克隆进行测序，结果表明，目的带分别长1262bp，1266bp，1268bp，与E亚群ev-1毒株env基因的同源性在96.1-96.5％，与B亚群的MAV-2毒株同源性为83％-85％，与C亚群的Pr-C毒株的同源性为84％-86％，与A亚群的RAV-1毒株的同源性最低，为79％-81％。经系统发育树分析表明所克隆的毒株与内源性病毒最接近。对序列运用Primer Premier 5.0软件分析其酶切位点情况发现， ＃、。人耸 y川3屁M卜”＞V。寸＜二 SSpl位于目的序列白635hp，将目的带切成627－635hp大小白片段，不带有Bglll 酶切位点，与PCR产物亘接进行酶切的结果相符。 研究的结果表明，运用PCR／RFLP可以对新分离的田间经典型ALVS进 行初步分型，这是一种简单、快捷的方法。