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《广西大学》 2004年
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小鼠胚胎干细胞培养及神经分化的研究

蒙超衡  
【摘要】:1.剪刀切割结合针头挤压小鼠胎儿组织能有效获得均匀、大小适中并容易贴壁生长的小组织块。将这些组织块培养48h,大量的梭形细胞从贴壁小组织块的边缘游离出的,细胞密度大,细胞生长旺盛,很快形成原代小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)单层。MEF用5μg/ml的丝裂霉素处理2.5-4h,10μg/ml的丝裂霉素处理1-4h或20μg/ml的丝裂霉素处理1-2.5h均可有效抑制其分裂,并保持细胞的正常活力;用14、21、28GRAY的γ射线处理,亦可有效抑制MEF的分裂,保持细胞的正常活力。 2.小鼠ES细胞解冻后,在饲养层培养体系用含LIF(1000U/ml)的完全培养液培养48h时,ES细胞形成边界清晰光滑的克隆,克隆内细胞排列紧密,难以辩认单个细胞,克隆边缘未见分化细胞;此时Oct-4细胞表达强烈的Oct-4-GFP绿色荧光,RT-PCR检测到细胞有高水平的Oct-4 mRNA,碱性磷酸酶AKP反应结果呈强阳性,表明细胞处于良好的未分化形态。如果在无饲养层培养体系培养48h,ES细胞出现了不同分化程度的克隆形态,表明饲养层能较好地控制ES细胞复苏时分化的发生。 3.将在饲养层培养体系中已培养2-3代的ES细胞接种于有饲养层及预铺了0.1%明胶(无饲养层)的96孔板中培养,在培养液中添加1000,1500,2000IU/ml的LIF能显著提高ES细胞的阳性度(有饲养层培养:17.80±3.26,19.58±3.19,21.8±3.17 vs 2.69±0.26;无饲养层培养:14.14±2.35,17.87±2.38,19.21±2.92 vs 0.016±0.0005,p<0.01)及克隆形成率(有饲养层培养:29.1%,31.8%,33.5%vs 6.5%:无饲养层培养:24.7%,27.8%,31.2%vs 0.8%,p<0.01);但不同浓度LIF之间的阳性度及克隆形成率差异不显著(p>0.05)。当不添加LIF时,饲养层培养法能显著地地提高ES细胞的AKP阳性度及克隆形成率(2.69±0.26 vs 0.016±0.0005;6.5%vs 0.8%,p<0.01)。说明饲养层细胞在ES细胞的分化抑制中有一定作用,而起主导作用的是外源LIF。 4.培养液种类及添加谷氨酰胺、丙酮酸钠和非必需氨基酸对ES细胞体外培养的效果影响较小,而培养用水和血清品质对ES细胞体外培养的效果影响较大。 Milli-Q水经亚沸处理能显著提高ES细胞保持未分化状态的能力,优质胎牛血清能提高ES的AKP阳性度和克隆形成率。 5.ES细胞用单层分化法在无血清的DMEM/F12+N2B27培养基中进行神经分化时,0-56h克隆逐渐变大,变扁平,边缘逐渐不整齐;96h后,在克隆的边缘 摘要 出现了向外迁移的、有1一2个突起的圆形或椭圆形细胞,在191h时,细胞可 迁移至克隆边缘的200脚之外,这些有细长突起的细胞表达神经元特异性蛋 白丁妞”。以后,迁移细胞的突起开始交叠成网状。316h时,细长的纤维可跨越 在不同的克隆之间,长达上千微米。细胞免疫染色检测结果显示,神经分化产 生了三种分化的主要细胞:Nestin阳性的神经干细胞、GFAP阳性的神经胶质 细胞、p一tubulinm阳性的神经元。对阶段性基因表达的变化观察发现,ES 细胞的特异性转录因子Oct一4开始减弱时,神经干细胞特异性基因Soxl表达 开始,表明细胞由全能状态进入早期神经分化状态,神经元特异性蛋白Tau 的表达在Soxl表达之后。在4一/4+程序神经分化的D13,成团的46C细胞中, 仍可观察到Soxl-GFP绿色荧光的表达,此时的细胞免疫化学染色检测到 Nestin阳性、GFAP阳性的细胞及p一tubulin 111阳性细胞,以p一tubulin 111阳性 细胞最为多见,它们呈现出多种形态。结果表明,4一/4+程序及单层分化法都 为ES细胞的神经分化提供了从神经分化起始到神经细胞发生所需的环境,但 两种方法获的p一tubulin一111阳性神经元在形态上有较大的区别,提示它们是处 于不同发育阶段的神经元。 6.在含LIF的ES细胞完全培养液中连续培养至48h的ES细胞,其自发分化处 于低水平状态,培养至122h时,这一比例随着培养的天数的增加而略有增加。 用含LIF的ES细胞完全培养液预培养24h的ES细胞,在后续的神经分化中, 早期神经干细胞特异性基因Soxl、神经元特异性基因丁妞u的表达时序与胚胎 发育过程相符,分化产生了神经干细胞、神经胶质细胞和神经元,细长的神经 纤维交织成广泛而复杂的网状图像;用含LIF的ES细胞完全培养液预培养72h 的ES细胞,在后续的分化实验中,出现了二种结果:①部分细胞去分化成为 大细胞;②部分细胞进入神经分化,二种分化过程都伴随有细胞死亡增加的现 象。在进入神经分化的细胞中,其分化的进程与预培养24h组相似,但向外迁 移的细胞减少,缺乏广泛的神经纤维联系。结果表明:ES细胞的自发分化程 度将严重地影响其后续的神经分化结果,自发分化程度高的细胞定向分化中会 产生去分化及死亡现象,它们的存在虽然不能完全阻止其周围的自发程度低的 ES细胞起始神经分化,也不改变其神经分化进程,但会影响其神经分化程度。
【学位授予单位】:广西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q813

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